一、用途

HKM^®鏈球菌乳膠試劑盒用于對選擇性平板上分離出的可疑鏈球菌以Lancefield方法進(jìn)行A、B、C、D、F和G分群。

從感染鏈球菌病人分離出的大部分鏈球菌具有特異性血清群抗原。鑒定這些菌株包括從培養(yǎng)物中提取和鑒定這些特異性抗原。鏈球菌分群系統(tǒng)試劑盒內(nèi)有可快速提取碳水化合物抗原的酶試劑和可快速鑒定提取出的A、B、C、D、F和G特異抗原的系列乳膠試劑。

該試劑盒僅供專業(yè)人員使用。

二、原理

試劑盒內(nèi)乳膠試劑顆粒表面包被與鏈球菌A、B、C、D、F或G群碳水化合物抗原分別具有特異性的兔抗體。

從平板上分離的可疑鏈球菌菌落經(jīng)酶試劑培養(yǎng)以提取抗原，提取出的抗原在檢測板用6種分別含有一種A、B、C、D、F或G特異性抗體的乳膠試劑懸液測試，如果存在某抗原，其對應(yīng)的乳膠顆粒會(huì)凝集，而其它乳膠試劑則保持光滑狀態(tài)。

三、試劑盒組成成分

每個(gè)試劑盒內(nèi)含50次測試的試劑，試劑瓶標(biāo)簽上標(biāo)有每種試劑的失效期。

HM47a REAG A   試劑A　　2.5mL

含有包被鏈球菌A群的兔抗體乳膠顆粒及穩(wěn)定劑和0.099%疊氮化鈉防腐劑的緩沖液。

HM47b REAG B 　試劑B　 2.5mL

含有包被鏈球菌B群的兔抗體乳膠顆粒及穩(wěn)定劑和0.099%疊氮化鈉防腐劑的緩沖液。

HM47c REAG C　 試劑C　 2.5mL

含有包被鏈球菌C群的兔抗體乳膠顆粒及穩(wěn)定劑和0.099%疊氮化鈉防腐劑的緩沖液。

HM47d REAG D　 試劑D　 2.5mL

含有包被鏈球菌D群的兔抗體乳膠顆粒及穩(wěn)定劑和0.099%疊氮化鈉防腐劑的緩沖液。

HM47f REAG F　 試劑F　 2.5mL

含有包被鏈球菌F群的兔抗體乳膠顆粒及穩(wěn)定劑和0.099%疊氮化鈉防腐劑的緩沖液。

HM47g REAGG　 試劑G　 2.5mL

含有包被鏈球菌G群的兔抗體乳膠顆粒及穩(wěn)定劑和0.099%疊氮化鈉防腐劑的緩沖液。

　HM47ｐCONTROL + 　陽性對照試劑　1.0mL

含有無活性的鏈球菌A、B、C、D、F和G多價(jià)抗原提取物和0.099%的疊氮化鈉防腐劑。

HM47x  ENZ 　　酶試劑　2×10mL

凍干的酶提取試劑

使用說明書

檢測板

攪拌棒

需要的其它材料

l         接種環(huán)

l         塑料或玻璃試管

l         可分裝0.4mL容積的移液器

l         37℃水浴鍋

l         樣品滴管或移液管

l         實(shí)驗(yàn)室計(jì)時(shí)器

四、警告和注意事項(xiàng)

1、試劑僅供體外診斷使用。

2、不要使用過期產(chǎn)品。

3、不要造成試劑或樣品的交叉污染。

4、按說明書使用試劑盒。

5、不要用嘴吸取試劑或樣品。

6、所有臨床樣品及其培養(yǎng)物均應(yīng)遵循按潛在傳染性產(chǎn)品的處理程序。被污染的物品可用3%的次氯酸鈉消毒處理30分鐘。含酸的廢液應(yīng)作中和處理。

7、試劑盒內(nèi)作防腐劑使用的0.099%疊氮化鈉應(yīng)小心處理，疊氮化鈉可與鉛或銅制品反應(yīng)形成易爆的金屬疊氮化物。可用大量水沖洗以避免疊氮化物的堆積。

五、貯存

檢測試劑盒不使用時(shí)應(yīng)貯存在2～8℃，不要凍存。在這種條件下，可保證包裝盒內(nèi)的產(chǎn)品在有效期內(nèi)的有效性。

試劑盒內(nèi)酶提取試劑在加水溶解后，2～8℃保存時(shí)，可使用3個(gè)月。如需延長保存期，可在溶解后每支試管分裝0.4mL，在－20℃或更低的溫度下凍存可使用6個(gè)月。酶試劑不可重復(fù)解凍和凍存。

顯示變質(zhì)的跡象

出現(xiàn)下列情況時(shí)，產(chǎn)品可能失效：

l         乳膠試劑出現(xiàn)明顯結(jié)塊，并且強(qiáng)烈搖動(dòng)幾秒鐘后無法消除。

l         陽性對照試劑或酶試劑出現(xiàn)絮狀或沉淀

l         在規(guī)定時(shí)間內(nèi)，陽性對照試劑與1個(gè)或幾個(gè)乳膠試劑反應(yīng)不出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。

l         未接種的酶試劑與乳膠試劑出現(xiàn)凝集反應(yīng)。

不要使用發(fā)生變質(zhì)跡象的產(chǎn)品。

六、樣品及其準(zhǔn)備

試劑盒用于檢測在培養(yǎng)基上經(jīng)過夜培養(yǎng)的可疑鏈球菌菌落。對于樣品收集及處理、接種及培養(yǎng)用的培養(yǎng)基可參考相關(guān)資料。檢測的可疑菌落可選取平板上初步分離的培養(yǎng)物或再次轉(zhuǎn)接的新鮮純培養(yǎng)物。不可直接檢測保存的菌株。溶血特性是鑒定分析中的一個(gè)重要特征，是否作溶血性鑒定分析取決于檢測的可疑菌落是否來自血基礎(chǔ)培養(yǎng)。

七、檢測過程

質(zhì)量控制：

應(yīng)定期作陽性對照測試，以確證檢測試劑的有效性。

在測試過程中，應(yīng)準(zhǔn)備好陽性對照試劑，并代替用酶試劑制成的菌懸液進(jìn)行測試。陽性對照試劑應(yīng)與所有的乳膠試劑形成凝集反應(yīng)。如果未出現(xiàn)凝集表明試劑失效。

如果需要作陰性對照檢測，可用不加培養(yǎng)物的酶試劑代替用酶試劑制成的菌懸液進(jìn)行測試。

測試程序：

1、所有試劑在使用前應(yīng)達(dá)到室溫。

2、在使用前，加10mL蒸餾水溶解酶試劑。輕輕搖動(dòng)，以溶解均勻。每個(gè)試管中分裝0.4mL酶提取液。

3、用接種環(huán)從平板中挑取可疑的鏈球菌菌落加入酶溶液中，制成菌懸液。為保證檢測結(jié)果，至少應(yīng)取4－5個(gè)常規(guī)大小的菌落或相當(dāng)?shù)慕臃N量。酶溶液中接種量過多時(shí)，可引起非特異性凝集（如13.1.3）。如果菌落微小，應(yīng)洗脫大量菌落。

4、將試管置37℃水浴鍋中恒溫10～15分鐘。恒溫5分鐘時(shí)，應(yīng)搖動(dòng)試管。在檢測前應(yīng)充分振搖試管，以獲得均勻的抗原懸液。

5、在使用前，搖動(dòng)乳膠試劑以形成均勻的懸浮液。然后將各種已搖勻的乳膠試劑分別各滴1滴在6個(gè)不同的反應(yīng)環(huán)內(nèi)。

6、分別在6個(gè)已滴加乳膠試劑的反應(yīng)環(huán)內(nèi)滴加1滴酶提取液（或陽性對照試劑，見“對照”部分）

7、分別用不同的攪拌棒混勻反應(yīng)環(huán)內(nèi)的2滴試劑，并在整個(gè)反應(yīng)環(huán)內(nèi)涂布均勻。不要用同1支攪拌棒混勻不同反應(yīng)環(huán)內(nèi)的溶液。

8、輕輕搖動(dòng)檢測板1分鐘上，以充分混合環(huán)內(nèi)的溶液。

9、觀察并記錄凝集結(jié)果，如果存在鏈球菌，應(yīng)會(huì)形成肉眼可見的明顯凝集。

八、結(jié)果判斷

在1分鐘的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，如果形成肉眼可見的凝集，表明菌懸液是陽性。如果提取物中抗原濃度較高，可快速形成大塊凝集顆粒，如果菌懸液提取物中抗原濃度較低，凝集所需時(shí)間較長，凝集的顆粒會(huì)較小。但陽性和陰性反應(yīng)結(jié)果區(qū)別依然較明顯。

如果乳膠試劑保持原來的光滑乳狀，無明顯凝集，說明菌懸液是陰性。如果有不明顯的微弱凝集，應(yīng)忽略，判斷為陰性。

預(yù)期結(jié)果

β－溶血的菌落：

1、單個(gè)乳膠試劑凝集表明該菌株鑒定為相應(yīng)的血清群。

以下情況應(yīng)考慮增加其它的驗(yàn)證試驗(yàn)：

l         對于D群菌株，應(yīng)做生化鑒定分析以區(qū)分D群鏈球菌菌株與D群腸球菌（其對抗生素有較高的抗性）。

l         對于菌落微小的A、C或G群菌株，應(yīng)做生化鑒定以證實(shí)為S.milleri或咽峽炎鏈球菌。

2、多個(gè)乳膠試劑凝集，表明不同群的多個(gè)菌落混合生長，或單一菌株有多個(gè)群的抗原（如D群鏈球菌同時(shí)含有G群抗原）�？梢赃M(jìn)一步考慮下列實(shí)驗(yàn)：

l         進(jìn)一步分離培養(yǎng)以獲得純菌落重新進(jìn)行測試。

l         同時(shí)含有D群和G群抗原的菌株應(yīng)進(jìn)一步做生化鑒定以區(qū)分腸球菌與D群鏈球菌菌株（含兩種抗原的腸球菌可能比只含有D抗原的菌株對抗生素抗性更強(qiáng)）。

3、所有乳膠試劑均凝集，可能是加入酶溶液中的接種物過多，或測試的培養(yǎng)物有污染菌株引起非特異性凝集，（一般情況下，可以通過識別菌落特征以確認(rèn)）�？梢赃M(jìn)一步考慮下列實(shí)驗(yàn)：

l         使剩余的酶提取物沸騰2～3分鐘上，冷卻后進(jìn)行重新測試，可能得到清晰的結(jié)果。

l         減少酶溶液中的接種物，重新測試。

l         進(jìn)一步分離培養(yǎng)，獲得純菌落重新進(jìn)行測試。

4、乳膠試劑均無明顯凝集，測試樣品中可能無A、B、C、D、F或G群鏈球菌存在，或存在的數(shù)量低于檢測限�？梢赃M(jìn)一步考慮下列實(shí)驗(yàn)：

l         使用較多接種物重新進(jìn)行測試，特別在懷疑是鏈球菌D群或F群的情況時(shí)。

l         未得到分群結(jié)果的β－溶血鏈球菌，必要時(shí)用生化實(shí)驗(yàn)進(jìn)行鑒定分析。

非β－溶血的菌落：

如果出現(xiàn)單一的乳膠凝集結(jié)果顯示為B群或D群，可較好的表明菌株所鑒定的結(jié)果。如果結(jié)果顯示為A、C、F或G群，則不能說明菌株為所鑒定的結(jié)果，應(yīng)采用其它鑒定方法。

可以考慮增加以下程序：

l      如果結(jié)果顯示為D群，應(yīng)做進(jìn)一步的生化鑒定以區(qū)分腸球菌與D群鏈球菌。

其它相關(guān)結(jié)果應(yīng)參考以上信息進(jìn)行判斷。

九、使用的局限性

結(jié)果應(yīng)依據(jù)所有的臨床或?qū)嶒?yàn)室信息進(jìn)行判斷。精確的結(jié)果依賴于適當(dāng)?shù)木�株濃度。偶爾可能�?huì)存在下列情況：部分D群菌株的特征性抗原含量低或較微量。某些F群菌株較難從平板表面挑起，瓊脂培養(yǎng)基上添加0.51%～1%的葡萄糖可促進(jìn)D群抗原的產(chǎn)生。添加葡萄糖會(huì)影響溶血現(xiàn)象的觀察。但當(dāng)血清群的鑒定非常重要時(shí)值得考慮添加葡萄糖。

菌落較小的菌株培養(yǎng)時(shí)增加二氧化碳的含量可促進(jìn)生長。

鏈球菌Q、R和S群可能也含有可檢測水平的D群抗原。

據(jù)報(bào)道，某些不相關(guān)的屬種含有類似于鏈球菌各群的抗原。例如埃希氏菌、克雷伯氏菌和假單胞菌可引起假陽性結(jié)果。通常情況下，這些菌株可從菌落形態(tài)上加以區(qū)別，不會(huì)造成鑒定時(shí)的混淆。

十、檢測效果對比

HKM^®鏈球菌乳膠試劑盒與一種已廣泛使用的商業(yè)化的乳膠試劑盒檢測效果對比，用二種產(chǎn)品檢測各獨(dú)立地點(diǎn)的臨床樣品。綜合結(jié)果如表1。

靈敏度　607/662＝92%

特異性　24/24＝100%

十一、重復(fù)性

批內(nèi)重復(fù)性：通過以系列稀釋度的參照抗原和試劑盒對照抗原對同1批產(chǎn)品的靈敏度進(jìn)行檢測。由不同的操作者隨機(jī)測試3次，最終效價(jià)由參考/對照抗原測定，并且3次定性分析結(jié)果完全一致。