1 與氣相色譜相比液相色譜的優(yōu)點(diǎn) ：與氣相色譜法相比，液相色譜法不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性及相對(duì)分子質(zhì)量的限制，只要求把樣品制成溶液即可，非常適合于分離生物大分子、離子型化合物，不穩(wěn)定的天然產(chǎn)物以及其他各種高分子化合物等。此外，液相色譜的流動(dòng)相不僅起到使樣品沿色譜柱移動(dòng)的作用，而且與固定相一樣，與樣品分子發(fā)生選擇性的相互作用，這就為控制和改善分離條件提供了一個(gè)額外的可變因素。而氣相色譜法采用的流動(dòng)相是惰性氣體，對(duì)組分沒有親和力，僅起運(yùn)載作用。

2 液相色譜特點(diǎn) ：高壓、高速、高效、高靈敏度、高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定有機(jī)及生化試樣的高效分離分析方法。

3 高效液相相色譜儀的組成 ：高壓輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測(cè)系統(tǒng)、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。

4 流動(dòng)相使用前必須脫氣。常用的脫氣方法有 ：低壓脫氣法(電磁攪拌、水泵抽空，可同時(shí)加熱或向溶劑吹氮?dú)?、吹氦氣脫氣法和超聲波脫氣法等。

5 梯度洗脫 ：用兩種(或多種)不同極性的溶劑，在分離過程中按一定程序連續(xù)改變流動(dòng)相中溶劑的配比和極性，通過流動(dòng)相中極性的變化來改變被分離組分的分離因素，以提高分離效果。

6 高壓梯度(內(nèi)梯度)：特點(diǎn)是先加壓后混合。將溶劑用高壓泵增壓以后輸入色譜系統(tǒng)的梯度混合室，加以混合后送入色譜柱。

低壓梯度(外梯度) ：特點(diǎn)是先混合后加壓。在常壓下預(yù)先按一定的程序?qū)⑷軇┗旌虾笤儆帽幂斎肷�譜柱。

7 進(jìn)樣系統(tǒng) 要求 ：良好的密封性，最小的死體積，最好的穩(wěn)定性，進(jìn)樣時(shí)對(duì)色譜系統(tǒng)壓力、流量影響較小。

8 分離系統(tǒng)：色譜柱是實(shí)現(xiàn)分離的核心部件。由柱管和固定相組成。柱管為直型不銹鋼管。一般色譜柱長5~30 cm，內(nèi)徑4~5 mm，凝膠色譜柱內(nèi)徑3~12 mm，而制備色譜柱內(nèi)徑則可達(dá)25 mm。一般淋洗溶劑在進(jìn)入色譜分離柱之前，先通過前置柱。HPLC柱的填料顆粒粒徑一般約為3~10 m，填充常采用勻漿法。色譜柱的發(fā)展趨勢(shì)是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。

9 檢測(cè)系統(tǒng) ：作用——用來連續(xù)監(jiān)測(cè)經(jīng)色譜柱分離后的流出物的組成和含量變化的裝置。紫外-可見吸收檢測(cè)器、光電二極管陣列檢測(cè)器、示差折光檢測(cè)器、熒光檢測(cè)器、電化學(xué)檢測(cè)器。

10 高效液相色譜法對(duì)流動(dòng)相的要求 ：流動(dòng)相不與色譜柱發(fā)生不可逆化學(xué)變化，以保持柱效或柱子的保留性質(zhì)較長時(shí)間不變;對(duì)待測(cè)樣品有足夠的溶解能力;與所用檢測(cè)器相匹配;粘度盡可能小，以獲得較高的柱效;流動(dòng)相純度要高，價(jià)格便宜，毒性小。

11 高效液相色譜法的固定相的分類 ：

(1)按固定相承受壓力分：剛性固體：以二氧化硅為基質(zhì)，可承受較高壓力，表面可鍵合各種功能官能團(tuán)---鍵合固定相，是目前應(yīng)用最廣泛的固定相。硬膠：主要用于離子交換色譜法和凝膠色譜法中，由聚苯乙烯與二乙烯基苯交聯(lián)而成，可承受的壓力較低。

(2)按孔隙深度分：表面多孔型：基體是球形玻璃珠，在玻璃表面涂覆一層多孔活性物質(zhì)如硅膠、氧化鋁、聚酰胺、離子交換樹脂、分子篩等。優(yōu)點(diǎn)：適用于快速分離、填充均勻緊密、機(jī)械強(qiáng)度高、能承受高壓，適于簡單的樣品及常規(guī)分析:缺點(diǎn)：多孔層薄，進(jìn)樣量受限制。全多孔型：由硅膠顆粒聚集而成，比表面積大，柱容量大，小顆粒全孔型固定相孔洞淺傳質(zhì)速率快，柱效高，分離效果好，適合于復(fù)雜樣品、痕量組分的分離分析，是目前HPLC中應(yīng)用最廣泛的固定相。

12 液固吸附色譜法原理：是以固體吸附劑為固定相，吸附劑表面的活性中心具有吸附能力，試樣分子被流動(dòng)相帶入柱內(nèi)時(shí)，它將與流動(dòng)相溶劑分子在吸附劑表面發(fā)生競爭吸附。分離過程是一個(gè)吸附-解吸的平衡過程。

13 液固吸附色譜法固定相 ：通常是硅膠、氧化鋁、活性炭等固體吸附劑。硅膠最常用。流動(dòng)相：極性大的試樣需用極性強(qiáng)的洗脫劑，極性弱的試樣宜用極性弱的洗脫劑。應(yīng)用 ：幾何異構(gòu)體分離和族分離，如農(nóng)藥異構(gòu)體;石油中烷、烯、芳烴的分離。不適于強(qiáng)極性的離子型樣品的分離，不適于分離同系物(因?yàn)樗鼘?duì)相對(duì)分子質(zhì)量的選擇性較小)。

14 液液分配色譜法原理 ：根據(jù)物質(zhì)在兩種互不相溶(或部分互溶)的液體中溶解度的不同實(shí)現(xiàn)分離。分配系數(shù)較大的組分保留值也較大。

15 液液分配色譜法流動(dòng)相 ：流動(dòng)相與固定液應(yīng)盡量不互溶，或者二者的極性相差越大越好。根據(jù)流動(dòng)相與固定相極性的差別程度，可將液液色譜分為正相分配色譜(流動(dòng)相極性小于固定相極性，極性小的先流出，適于強(qiáng)極性和中等極性組分分離)和反相分配色譜(流動(dòng)相極性大于固定相極性，極性大的先流出，適于非極性或弱極性組分分離)。固定相 ：由載體和固定液組成。常用的固定液有b,b’-氧二丙腈、聚乙二醇、聚酰胺、正十八烷、角鯊?fù)榈�。�?yīng)用 ：同系物組分的分離。例：分離水解蛋白質(zhì)所生成的各種氨基酸，分離脂肪酸同系物等。

16 化學(xué)鍵合固定相 ：化學(xué)鍵合固定相是利用化學(xué)反應(yīng)將有機(jī)分子鍵合到載體表面上，形成均一、牢固的單分子薄層而構(gòu)成各種性能的固定相。

17 化學(xué)鍵合固定相的特點(diǎn) ：固定相不易流失，柱的穩(wěn)定性和壽命較高;能耐受各種溶劑，可用于梯度洗脫;表面較為均一。沒有液坑，傳質(zhì)快，柱效高;能鍵合不同基團(tuán)以改變其選擇性。例如，鍵合氰基、氨基等極性集團(tuán)用于正相色譜法，鍵合離子交換基團(tuán)用于離子色譜法，鍵合C2，C4，C6，C8，C18，C16，C18，C22烷基和苯基等非極性基團(tuán)用于反相色譜法等。因此，它是HPLC較為理想的固定相。

18 離子交換色譜法原理 ：離子交換色譜法的固定相是離子交換樹脂，流動(dòng)相是水溶液，它是利用待測(cè)樣品中各組分離子與離子交換樹脂的親和力的不同而進(jìn)行分離的。

19 離子交換色譜法流動(dòng)相 ：水的緩沖溶液。陰離子離子交換樹脂作固定相，采用酸性水溶液;陽離子離子交換樹脂作固定相，采用堿性水溶液;應(yīng)用：離子及可離解的化合物，氨基酸、核酸等。

20 凝膠色譜法原理 ：凝膠色譜法的固定相為多孔性凝膠類物質(zhì)，流動(dòng)相為水溶液或有機(jī)溶劑，它是根據(jù)不同組分分子體積的大小進(jìn)行分離的。小分子可以擴(kuò)散到凝膠空隙，由其中通過，出峰最慢;中等分子只能通過部分凝膠空隙，中速通過;而大分子被排斥在外，出峰最快;溶劑分子小，故在最后出峰。全部在死體積前出峰;可對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量在100-105范圍內(nèi)的化合物按質(zhì)量分離。

21 凝膠色譜法流動(dòng)相 ：能溶解樣品且與凝膠相似(潤濕凝膠并防止吸附作用)、粘度小(增加擴(kuò)散速度)。常用四氫呋喃、苯、氯仿、水等。

22 影響分離的因素與提高柱效的途徑 :(1)液體的黏度比氣體大一百倍，密度為氣體的一千倍左右，故降低傳質(zhì)阻力是提高柱效主要途徑。(2)由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。(3)液相色譜中，不可能通過增加柱溫來改善傳質(zhì)。(4)恒溫改變淋洗液組成、極性是改善分離的最直接的因素。(5)流速大于0.5 cm/s時(shí), H～u曲線是一段斜率不大的直線。降低流速，柱效提高不是很大。但在實(shí)際操作中，流量仍是一個(gè)調(diào)整分離度和出峰時(shí)間的重要可選擇參數(shù)。(6)氣相色譜中的固定液原則上都可以用于液相色譜，其選用原則與氣相色譜一樣。但在高效液相色譜中，分離柱的制備是一項(xiàng)技術(shù)要求非常高的工作，一般很少自行制備。

2 質(zhì)譜的作用 ：準(zhǔn)確測(cè)定物質(zhì)的分子量;質(zhì)譜法是唯一可以確定分子式的方法;根據(jù)碎片特征進(jìn)行化合物的結(jié)構(gòu)分析。

3 質(zhì)譜分析的基本原理 ：質(zhì)譜法是利用電磁學(xué)原理，將待測(cè)樣品分子解離成具有不同質(zhì)量的離子，然后按其質(zhì)荷比(m/z)的大小依次排列收集成質(zhì)譜。根據(jù)質(zhì)譜中的分子離子峰(M+)可以獲得樣品分子的相對(duì)分子質(zhì)量信息;根據(jù)各離子峰(分子離子峰、同位素離子峰、碎片離子峰、亞穩(wěn)離子峰、重排離子峰等)及其相對(duì)強(qiáng)度和氮數(shù)規(guī)則，可以確定化合物的分子式;根據(jù)各離子峰及物質(zhì)化學(xué)鍵的斷裂規(guī)律可以進(jìn)行定性分析和結(jié)構(gòu)分析;根據(jù)組分質(zhì)譜峰的峰高與濃度間的線性關(guān)系可以進(jìn)行定量分析。

4 質(zhì)譜分析的過程 ：（1）進(jìn)樣，化合物通過汽化引入電離室;（2）離子化，在電離室，組分分子被一束加速電子碰撞，撞擊使分子電離形成正離子;（3）離子也可因撞擊強(qiáng)烈而形成碎片離子;（4）荷正電離子被加速電壓V加速，產(chǎn)生一定的速度v，與質(zhì)量、電荷及加速電壓有關(guān);（5）加速正離子進(jìn)入一個(gè)強(qiáng)度為B的磁場(chǎng)(質(zhì)量分析器)，發(fā)生偏轉(zhuǎn)。

5 質(zhì)譜儀的組成 ：真空系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、離子源或電離室、質(zhì)量分析器、離子檢測(cè)器。

6 真空系統(tǒng)作用 ：是減少離子碰撞損失。若真空度低：大量氧會(huì)燒壞離子源的燈絲;會(huì)使本底增高，干擾質(zhì)譜圖;引起額外的離子-分子反應(yīng)，改變裂解模型，使質(zhì)譜解釋復(fù)雜化;干擾離子源中電子束的正常調(diào)節(jié);用作加速離子的幾千伏高壓會(huì)引起放電等。

7 進(jìn)樣系統(tǒng)目的 ：高效重復(fù)地將樣品引入到離子源中并且不能造成真空度的降低。間歇式進(jìn)樣系統(tǒng)——氣體及低沸點(diǎn)、易揮發(fā)的液體;直接探針進(jìn)樣——高沸點(diǎn)的液體、固體;色譜進(jìn)樣系統(tǒng)——有機(jī)化合物。

8 離子源或電離室：作用是使試樣中的原子、分子電離成離子，其性能影響質(zhì)譜儀的靈敏度和分辨率本領(lǐng)。8電子電離源的特點(diǎn)：電離電壓：70eV;加一小磁場(chǎng)增加電離幾率;EI源電離效率高,碎片離子多，結(jié)構(gòu)信息豐富，有標(biāo)準(zhǔn)化合物質(zhì)譜庫;結(jié)構(gòu)簡單，操作方便;樣品在氣態(tài)下電離，不能汽化的樣品不能分析，主要用于氣-質(zhì)聯(lián)用儀;有些樣品得不到分子離子。

9 化學(xué)電離源特點(diǎn) ：電離能小，質(zhì)譜峰數(shù)少，譜圖簡單;最強(qiáng)峰為(M+1)+準(zhǔn)分子離子峰;不適用難揮發(fā)試樣。

10 快原子轟擊源 ：高能量的Xe原子轟擊涂在靶上的樣品，濺射出離子流。本法適合于高極性、大分子量、低蒸汽壓、熱穩(wěn)定性差的樣品。FAB一般用作磁式質(zhì)譜的離子源。

11 電噴霧源結(jié)構(gòu) ：噴嘴(金屬毛細(xì)管)，霧化氣，干燥氣。原理：噴霧蒸發(fā)電壓。特點(diǎn)：ESI是最軟的一種電離方式，只產(chǎn)生分子離子，不產(chǎn)生碎片離子;適用于強(qiáng)極性，大分子量的樣品分析，如肽，蛋白質(zhì)，糖等;產(chǎn)生的離子帶有多電荷，尤其是生物大分子;主要用于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，既用作液相色譜和質(zhì)譜儀之間的接口裝置，同時(shí)又是電離裝置。

12 場(chǎng)致電離源(FI) 和場(chǎng)解吸電離源(FD) ：分子離子峰強(qiáng);:碎片離子峰少;不適合化合物結(jié)構(gòu)鑒定。

13 基質(zhì)輔助激光解吸電離特點(diǎn) ：準(zhǔn)分子離子峰很強(qiáng)，且碎片離子少。通常用于飛行時(shí)間質(zhì)譜，特別適合測(cè)定多肽、蛋白質(zhì)、DNA片段、多糖等的相對(duì)分子質(zhì)量。

14 質(zhì)量分析器作用 ：將離子源產(chǎn)生的離子按質(zhì)荷比m/z的大小分開。

15 單聚焦分析器：離子的m/z與R,B, V有關(guān)。通過改變磁場(chǎng)可以把不同離子分開。-在一定磁感應(yīng)強(qiáng)度B下，改變加速電壓V可以使不同離子先后通過檢測(cè)器，實(shí)現(xiàn)質(zhì)量掃描，得到質(zhì)譜。特點(diǎn)：結(jié)構(gòu)簡單，操作方便;只有方向聚焦，無能量聚焦，分辨率低。

16 雙聚焦分析器 ：實(shí)現(xiàn)方向聚焦和能量(速度)聚焦;對(duì)于動(dòng)能不同的離子，通過調(diào)節(jié)電場(chǎng)能，達(dá)到聚焦的目的。特點(diǎn)：分辨率高。

17 四級(jí)桿質(zhì)量分析器 ：特點(diǎn)：結(jié)構(gòu)簡單，體積小、重量輕，掃描速率快，適合與色譜聯(lián)機(jī)。

18 飛行時(shí)間質(zhì)量分析器 ：特點(diǎn)：質(zhì)量范圍寬，掃描速率快，既不需磁場(chǎng)也不需電場(chǎng)，只需要直線漂移空間。

19 離子阱質(zhì)量分析器 ：特定m/z離子在阱內(nèi)一定軌道上穩(wěn)定旋轉(zhuǎn)，改變端電極電壓，不同m/z離子飛出阱到達(dá)檢測(cè)器。特點(diǎn)：結(jié)構(gòu)簡單、易于操作、靈敏度高。

20 質(zhì)譜的表示方法 ：質(zhì)譜一般可用線譜或表譜兩種方法表示。常用線譜;線譜上的各條直線表示一個(gè)離子峰，橫坐標(biāo)為質(zhì)荷比m/z，縱坐標(biāo)為離子的相對(duì)強(qiáng)度(相對(duì)豐度)，一般將原始質(zhì)譜圖上最強(qiáng)的離子峰定為基峰并定為相對(duì)強(qiáng)度100%，其他離子峰以對(duì)基峰的相對(duì)百分值表示。能夠很直觀地觀察到整個(gè)分子的質(zhì)譜全貌;質(zhì)譜表是用表格形式表示的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，質(zhì)譜表中有兩項(xiàng)即質(zhì)荷比及相對(duì)強(qiáng)度。對(duì)定量計(jì)算較直觀。

21 質(zhì)譜儀的分辨率 ：分辨率(R)指質(zhì)譜儀能區(qū)別鄰近兩個(gè)質(zhì)譜峰的能力。對(duì)兩個(gè)相等強(qiáng)度的相鄰峰，當(dāng)兩峰間的峰谷不大于其峰高10%時(shí)，則認(rèn)為兩峰已經(jīng)分開。

22 質(zhì)譜圖中主要離子峰的類型 ：分子離子峰、同位素離子峰、碎片離子峰、亞穩(wěn)離子峰、重排離子峰。

23 相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定 ：分子離子峰的m/z相當(dāng)于該化合物的相對(duì)分子質(zhì)量。一般除同位素離子峰外，分子離子峰是質(zhì)譜圖中最大質(zhì)荷比的峰，位于質(zhì)譜圖的最右端。

24 確認(rèn)分子離子峰的方法 ：(1)分子離子峰必須符合氮數(shù)規(guī)則。有機(jī)化合物含有偶數(shù)個(gè)氮原子或不含氮原子，分子離子峰的m/z一定是偶數(shù);含奇數(shù)個(gè)氮原子，分子離子峰的m/z一定是奇數(shù)。(2)分子離子峰與相鄰離子峰的質(zhì)量差應(yīng)合理，如不可能出現(xiàn)比分子離子峰質(zhì)量小4～13個(gè)質(zhì)量單位的峰。(3)當(dāng)化合物中含S,Br, Cl時(shí)，可利用M+, (M+2) +等同位素離子峰的比例來確認(rèn)分子離子峰。(4)改變質(zhì)譜儀的操作條件，提高分子離子峰的相對(duì)強(qiáng)度。采用化學(xué)電離源或降低電子轟擊源電壓可獲得較強(qiáng)的M+峰。

25 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 ：質(zhì)譜：純物質(zhì)結(jié)構(gòu)分析。色譜：化合物分離，定性能力差。色譜-質(zhì)譜聯(lián)用：共同優(yōu)點(diǎn)。GC-MS;LC-MS;CE-MS，色譜是質(zhì)譜的進(jìn)樣及分離系統(tǒng);質(zhì)譜是色譜的檢測(cè)器。主要問題：接口技術(shù);除去色譜中大量的流動(dòng)相分子。適用范圍：適用于揮發(fā)度低、難氣化、極性強(qiáng)、相對(duì)分子質(zhì)量大及熱穩(wěn)定性差的樣品。