有時候你會發(fā)現(xiàn)好像你用了大部分的實驗室經(jīng)費(fèi)在不停的買液相色譜柱。為什么色譜廠家不能把柱子的壽命延長一些呢？實際上，在合理的維護(hù)下，柱子可以成為液相分析花費(fèi)里面很小的一部分。舉一個例子，一根典型的反相柱子的花銷在3405-4087元之間， 如果它能進(jìn)樣500-1000次，那么每一次進(jìn)樣的花費(fèi)是3.4-6.8塊錢。

盡管費(fèi)用會隨著實驗室和特定方法不同而變化，完成一次常規(guī)的進(jìn)樣分析，340塊錢的總費(fèi)用是合理的，這也可由做委托檢測業(yè)務(wù)的第三方實驗室對類似分析的定價所確認(rèn)。

因此，我們上面談到色譜柱的花費(fèi)在總分析成本中只占1-2%，我們想方設(shè)法使柱子的壽命延長一倍，即使單根柱子的成本還是很高，實際上這樣做并不能在整個分析成本上降低很多。個人的感覺是如果你用一根柱子進(jìn)了500針，那這樣就已經(jīng)很劃算了。

首先，先看一下其他幾個色譜學(xué)家的經(jīng)驗。 Ron Majors，在他的“色譜柱觀察”專欄的某期連載文章中，已經(jīng)包含了針對色譜各個方面的用戶調(diào)查結(jié)果。他有關(guān)色譜柱壽命的大部分專欄文章是在2012年發(fā)表的，將作為我們目前討論的基礎(chǔ)。圖1是基于Ron Majors 2011年用戶調(diào)查數(shù)據(jù)的餅型圖。

可以看到有回應(yīng)的調(diào)查對象中接近四分之三的進(jìn)樣壽命在500針以上，而且有近二分之一達(dá)到了至少 1000次的進(jìn)樣壽命。這個結(jié)果對我來說是非常吃驚的，因為它包含了對所有類型的色譜柱的壽命調(diào)查，不僅僅是現(xiàn)代液相中的最吃苦耐勞的用得最多的主力色譜柱，4.6×150mm，5μm反相柱，相對于其它種類色譜柱，它甚至有點(diǎn)刀槍不入的味道。

圖1 分析柱的典型進(jìn)樣次數(shù)。數(shù)據(jù)基于2011 年調(diào)查

為了看清隨著時間變化情況改變的情形，我做了一個1997年到2011年四個調(diào)查結(jié)果的比較圖，見圖2�？梢钥吹接袔讉�明顯的趨勢。

第一，我注意到灰柱，灰柱代表的是在柱子損壞之前進(jìn)樣小于1000次的百分比，從1997年的76%跌倒了2011年的53%；同時有明顯對比的是代表能進(jìn)樣1000以上的黃柱高度增加很快。在上面我有提到我把進(jìn)樣500次作為柱子使用壽命的一個平衡點(diǎn)，我們可以發(fā)現(xiàn)在柱子壞之前進(jìn)樣次數(shù)達(dá)不到500次的用戶的數(shù)量明顯下降，從1997年的接近一半到2011的四分之一。

圖2 在LC柱子損壞之前進(jìn)樣次數(shù)的比較

最后我們可看到，有著可怕經(jīng)歷的用戶的數(shù)量，即那些只能做到100或者更少的進(jìn)樣次數(shù)的用戶，比例基本上沒有改變，徘徊在10%附近。

找出這種改變的原因只能是出于推測，但是我很樂意做此推斷。我不認(rèn)為柱子壽命有明顯的提升是因為柱子工藝的改進(jìn)。

不可否認(rèn)，在某個時期，柱子塌陷，或者是柱床中有空腔形成的情況非常普遍，但是在1997年開展調(diào)查的時間段，裝柱工藝就已經(jīng)非常成熟了，由于裝柱工藝導(dǎo)致柱子損壞的情況很少見。我認(rèn)為柱子壽命延長的主要原因是用戶受到更好的培訓(xùn)，從而對樣品前處理和柱子的物理保護(hù)更好了。

柱子的保護(hù)方法就是我想在下文著重說明的。我同時也推斷，進(jìn)樣次數(shù)很穩(wěn)定的小于100，與其說是柱子本身的原因，還不如說是實驗室操作存在問題，或者說是某些應(yīng)用方法本身就是“柱子終結(jié)者”。

在我的LC課堂中，我經(jīng)常開玩笑的說，延長柱子壽命的最好方法是不要打開色譜柱的盒子。一旦你開始進(jìn)樣，就開始了柱子走向滅亡的道路。樣品有兩個主要方面可以影響色譜柱—化學(xué)性質(zhì)和物理性質(zhì)。我們把樣品中不要的化學(xué)污染物和微型顆粒清除的越好，柱子的壽命就越長。

使用SPE(Solide-Phase extraction)，液液萃取和其他技術(shù)來除去化學(xué)污染物是LCGC中“Sample Prep Perspectives”專欄常有這樣的文章，我就不在這里多說了。一言以蔽之，越多的樣品前處理，越少的化學(xué)污染物進(jìn)入色譜柱，柱子壽命就越長。你還得平衡一下樣品前處理費(fèi)用和它帶來的好處。

比如，你買了柱芯和試劑，并加上你投入時間的費(fèi)用，你在每個樣品上SPE的花費(fèi)會很容易超過34塊錢，這是可以承受500次進(jìn)樣量的反相柱在每個樣品分析上分?jǐn)偝杀镜?倍多，這差不多需要將色譜柱進(jìn)樣次數(shù)從500次延長至2500次才扯平了。

另一方面，如果沒有做過任何處理的血漿樣品直接進(jìn)樣了，柱子可能就只能進(jìn)樣10次左右。你也要考慮到當(dāng)更多的樣品處理步驟加入的時候的數(shù)據(jù)質(zhì)量。我知道，在我們的實驗室中，這些措施可以讓我們在低濃度的時候收集到有用的數(shù)據(jù)并得到一致的結(jié)果，而不是比較少的前處理步驟可能得到的結(jié)果。

不論你做沒做其他前處理步驟，幾乎所有的樣品都會從樣品過濾，離心或者兩者中得到好處。樣品經(jīng)過一個一次性的過濾膜過濾來移除可能堵住柱子進(jìn)口篩板的細(xì)顆粒物。濾膜的孔徑不能大于柱子進(jìn)口篩板的孔徑。

大部分>3μm填料顆粒的柱子用2μm孔徑的篩板，3μm填料粒徑的柱子則一般用0.5μm的篩板，填料粒徑<3-μm的柱子，比如UHPLC，一般用0.2μm的進(jìn)口篩板。最常用的樣品過濾膜是0.45μm孔徑的，這個對除了亞2μm之外的其它柱子都已經(jīng)足夠，亞2μm柱子，則需用0.2μm的濾膜。

濾膜可作為預(yù)裝在一次性注射器中的柱芯，也作為96孔板的過濾板。即使這些過濾裝置一般是有效的，但我不是非常強(qiáng)烈的推薦使用。至少有4點(diǎn)使我不同意過濾樣品。

第一，樣品過濾成本比較昂貴，上一次我比較過價格，一次性購買1000份，每份的價格都要高于3.4元，這個與柱子在每次分析中的分?jǐn)傎M(fèi)用幾乎一樣。

 

第二，用0.5μm濾膜過濾很慢，而0.2μm濾膜則更慢。

 

第三，如果你在一個監(jiān)管嚴(yán)格的環(huán)境中工作，每一個樣品的處理步驟都必須一樣，這就是說，如果你過濾了一個樣品，那么其他剩余的樣品也都要過濾，無論實際上需不需要。

 

最后，如果你要驗證你的LC方法，就需要驗證所有的過濾步驟。在過濾的過程中，樣品會有損失——如果50μL樣品經(jīng)過濾膜，得到的樣品就少于50μL。

你得證明樣品不是選擇性的損失，特別是在高濃度或者低濃度的時候。因此，我們可以看到，樣品過濾是需要花很多功夫和金錢的。但是你要是不怕麻煩和不要求成本，樣品過濾是在大部分的情況下都是能提高柱子的壽命的。

樣品過濾的一個替代方法（或者是補(bǔ)充）是在進(jìn)樣之前離心。這是一個簡單又相對便宜的方法。只要把樣品放進(jìn)離心管，Eppendorf 離心管或者一個96孔的離心板，再放到小型臺式離心機(jī)里，調(diào)整轉(zhuǎn)速到其最大速度，旋轉(zhuǎn)5-10min。

這會使會引起篩板堵塞的顆粒沉積到樣品瓶的底部，然后把樣品轉(zhuǎn)移到進(jìn)樣瓶或板中繼續(xù)進(jìn)行分析。這種技術(shù)我們在實驗室中對需要沉淀蛋白質(zhì)的樣品中已經(jīng)使用了很多年，而且極少出現(xiàn)顆粒物質(zhì)相關(guān)的問題。

我曾經(jīng)見過這樣的例子，用0.2μm的濾膜過濾之后的樣品，UHPLC進(jìn)樣，這種樣品還是有一點(diǎn)渾濁并且引起了柱子堵塞，但是這個些微渾濁的樣品離心至澄清之后，柱子堵塞的情況就會減少很多。

我非常認(rèn)同一個在線的過濾器是LC或者UHPLC中使用成本最低的附加裝置，可以提供最大的投資回報。這種過濾器是一個非常簡單的改裝管配件，其中包含了一個特定孔徑的篩板，安裝在自動進(jìn)樣器和柱子（保護(hù)柱，如果用到的話）之間。

現(xiàn)在最普遍的裝置是一個直徑接近37.5px，長度62.5px不銹鋼配件，其中包含一個0.5或者0.2μm孔徑的可替換的篩板。另外一種裝置是包含相同孔徑大小篩板的PEEK手緊配件。這種PEEK過濾器整體是一次性的，但是因為它比不銹鋼過濾器中的一次性使用的篩板要貴，使用成本會比較昂貴。

這種在線過濾器孔徑會選擇比柱子篩板孔徑小一點(diǎn)，因此它會在柱子堵塞之前先被堵塞。當(dāng)系統(tǒng)壓力開始增加的時候，你就知道在線過濾器中篩板已經(jīng)開始堵了，需要在完全堵住之前替換掉。

在線過濾器可以起到單獨(dú)的樣品過濾器一樣的功能，但在樣品前處理時，不需要額外的人力工作。如果你樣品離心了，偶爾有一些顆粒沒有過濾掉，也會被下游的在線過濾器攔截住。

在線過濾器的另一優(yōu)點(diǎn)是它能夠很便捷的更換——如果你動手能力強(qiáng)，在5min內(nèi)你可以關(guān)掉泵、替換篩板、打開系統(tǒng)并繼續(xù)實驗。

你可能想要重新進(jìn)一針系統(tǒng)適應(yīng)性樣品來檢查一下系統(tǒng)有沒有出問題，使用在線過濾器不需要大量的調(diào)節(jié)和校準(zhǔn)，而這些在更換保護(hù)柱時都需要重新做過。在線過濾器的最后一個好處是可以過濾掉泵密封件和進(jìn)樣閥因磨損產(chǎn)生的顆粒物。我強(qiáng)烈建議在每一個LC系統(tǒng)中都安裝一個在線過濾器，即使你已經(jīng)在使用保護(hù)柱了。

保護(hù)柱（也叫做預(yù)柱）是一種很短的裝在分析柱上游的色譜柱。這種柱子長度一般為10-20mm，包含與分析柱一樣的填料，使用不大于分析柱篩板孔徑的入口篩板和出口篩板。

保護(hù)柱有雙重功能，第一，入口篩板攔截可能堵塞分析柱的顆粒物，第二，填料與分析柱相同，它可以捕抓住那些可能會強(qiáng)烈或者不可逆附著在分析柱填料上的物質(zhì)�？偹�周知，保護(hù)柱會延長分析柱的壽命，然而，保護(hù)柱有幾個潛在的問題。

第一，他們比較貴——價格高出分析柱的40%甚至更多，考慮到增加的成本時，你柱子的壽命是否有足夠的延長？

 

第二，保護(hù)柱到底能持續(xù)多長時間？你得知道更換柱子的時間，在保護(hù)柱上的化學(xué)污染物積累太多之前，就要想辦法避免污染物進(jìn)入到分析柱中。因此，需要對進(jìn)樣次數(shù)計數(shù)或者做一個系統(tǒng)適應(yīng)性實驗來決定什么時候更換保護(hù)柱。

 

第三，你要判斷怎么來清洗保護(hù)柱。為了防止把污染物沖洗到分析柱中，保護(hù)柱和分析柱需要分開來清洗嗎？

 

最后，你可能期望將一個20mm長的保護(hù)柱加裝到150mm長的分析柱上，使柱效提高10%，但是這種情況很少出現(xiàn)。原因是接入一根保護(hù)柱后，系統(tǒng)管路中會增加兩個柱頭連接件和一段管路，而且保護(hù)柱沒有分析柱裝柱那么容易安裝，以上兩個方面都會降低系統(tǒng)性能。結(jié)果就是如果你運(yùn)氣好的話，你會得到一樣的理論塔板數(shù)，但常見的情況是柱效會稍有降低。

要不要用保護(hù)柱的選擇權(quán)在你。保護(hù)柱確實能延長分析柱的壽命，但是我個人認(rèn)為在大多數(shù)情況下，這并不值得。

如果你選擇使用保護(hù)柱，我還是推薦在自動進(jìn)樣器和保護(hù)柱之間連接使用一個在線過濾器。過濾器的錢只有保護(hù)柱的零頭，它還能延長保護(hù)柱的使用壽命，就像它能延長分析柱壽命一樣。

盡管你不能讓你的分析柱壽命無限延長，但還是能用一些非常簡單的方法來延長色譜柱這個系統(tǒng)中比較昂貴部件的壽命。

首先，按照要求對樣品進(jìn)行前處理。樣品前處理的最后一步必須是過濾或者離心。其次，使用在線過濾器來保護(hù)保護(hù)柱和分析柱，免于被樣品中或者系統(tǒng)其它部分產(chǎn)生的顆粒物堵塞。再次，如果保護(hù)柱對你的應(yīng)用有意義的話，則使用保護(hù)柱來保護(hù)分析柱。最后，在每批樣品分析之后，使用強(qiáng)溶劑來沖洗柱子，除去在柱子上的任何強(qiáng)保留物質(zhì)。