研究?jī)?nèi)容

操作過程

一般技術(shù)要點(diǎn)說明

方法摸索優(yōu)化

目標(biāo)優(yōu)化梯度條件，確定分析波長(zhǎng)。

1、 樣品溶劑選擇；

2、 濾膜吸附試驗(yàn)；

3、 DAD檢測(cè)器下，波長(zhǎng)選擇主成分最大吸收或平臺(tái)處。

4、 分離條件選擇；

5、 色譜柱對(duì)比；（根據(jù)情況酌定）

6、DAD檢測(cè)器下，水、1mol/l酸、堿、氧（10%雙氧水）、光照、高溫破壞，各起始物料，中間體，輔料（制劑研究時(shí)需同時(shí)進(jìn)行空白輔料破壞）等成分分離。

1、 一般在無參考標(biāo)準(zhǔn)或標(biāo)準(zhǔn)的方法無法直接套用時(shí),需進(jìn)行此項(xiàng)研究?jī)?nèi)容，如3類藥。

2、樣品溶劑：對(duì)樣品有很好的溶解能力，實(shí)驗(yàn)室自然放置穩(wěn)定存放12小時(shí)以上，與流動(dòng)相有良好的互溶效果。

3、續(xù)濾液峰面積達(dá)穩(wěn)定最大值，續(xù)濾液體積在5ml以下時(shí)較為適宜，否則需要重新篩選溶劑。

4、破壞程度10%左右（5%—15%）為宜，2mol/l酸或堿90℃水浴12小時(shí)無破壞即視為樣品穩(wěn)定，不必再追求降解度。4500lx光照48小時(shí)，樣品粉末及溶液需要同時(shí)做。破壞后的樣品溶液及空白溶劑均需調(diào)整至流動(dòng)相pH方可進(jìn)樣，可避免對(duì)色譜柱產(chǎn)生不良影響。如果破壞超過20%，需要降低破壞條件。

5、分離度良好，測(cè)定無干擾，各峰峰純度符合單峰要求。

6、梯度變化要有最高洗脫能力過程，目的證明所有的雜質(zhì)成分均能夠被洗脫檢測(cè)。

7、方法摸索優(yōu)化實(shí)驗(yàn)一般是不上資料的，只是體現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)記錄本中，除非是沒有方法依據(jù)時(shí)，如3類藥申報(bào)時(shí)，梯度選擇及波長(zhǎng)選擇等均需要在資料中體現(xiàn)。

8、方法優(yōu)化完成后，最后在同一天同一人，用同一臺(tái)機(jī)器，對(duì)所有樣品進(jìn)行分析測(cè)定，具有可比性。

9、方法摸索優(yōu)化實(shí)驗(yàn)采用工藝已經(jīng)確定的實(shí)驗(yàn)室小試、實(shí)驗(yàn)室放大樣品進(jìn)行，前期用于原料合成樣品配合檢測(cè)時(shí)，可以采用大范圍的梯度洗脫進(jìn)行模糊檢測(cè)分析。

專屬性

目的為了驗(yàn)證方法對(duì)目標(biāo)成分檢測(cè)的區(qū)分能力及全面的雜質(zhì)分析評(píng)價(jià)。

DAD檢測(cè)器或適宜的通用型檢測(cè)器下，水、1mol/l酸、堿、氧（10%雙氧水）、光照、高溫破壞，各起始物料，中間體，輔料，各雜質(zhì)對(duì)照品等在同一天進(jìn)行分析，可以作為申報(bào)資料中雜質(zhì)譜的論述內(nèi)容。

1、參照上述過程進(jìn)行破壞樣品制備，空白及陰性樣品都要做。

2、分離度良好，測(cè)定無干擾，各峰峰純度符合單峰要求。

3、梯度要有最高洗脫能力過程。

4、以前期確定的分析條件及方法，在同一天同一人，用同一臺(tái)機(jī)器，對(duì)所有樣品進(jìn)行分析測(cè)定，具有可比性。

5、本部分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)資料，最佳采用生產(chǎn)線驗(yàn)證的第1批樣品進(jìn)行。

當(dāng)色譜條件與有關(guān)物質(zhì)檢查方法相同時(shí)，專屬性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以共用。

出圖時(shí)主成分峰的紫外光譜圖及峰純度圖均要出圖。

檢測(cè)限

信噪比法，S/N≥3倍時(shí)的濃度為檢測(cè)限。

先進(jìn)空白，再進(jìn)對(duì)照品濃溶液（1mg/ml），在主峰相同位置處選擇空白溶劑1—2min范圍的基線積分得出峰高，按照峰高的3倍計(jì)算樣品濃度，直接用濃溶液稀釋至目標(biāo)濃度附近即可，資料中體現(xiàn)至少3張圖（空白溶劑、濃溶液、及稀釋液）。

定量限

信噪比法，S/N≥10倍時(shí)的濃度為定量限。

按照基線峰高的10倍計(jì)算樣品濃度，直接用檢測(cè)限濃溶液稀釋至目標(biāo)濃度附近即可，連續(xù)進(jìn)樣6針，計(jì)算峰面積RSD<2%（可以放寬至5%），資料中體現(xiàn)6張圖（6張稀釋液）。與檢測(cè)限在同一天做，出圖時(shí)縱軸標(biāo)尺與檢測(cè)限一致，減少審評(píng)員審圖時(shí)的信息誤導(dǎo)，提高審圖效率。

線性與范圍

5點(diǎn)或7點(diǎn)法，酌情設(shè)置。

1、第一個(gè)點(diǎn)在定量限濃度，中間點(diǎn)為100%濃度，最后一個(gè)點(diǎn)為200%濃度（160%或180%），必須采用稀釋法，不得采用調(diào)整進(jìn)樣量的方式。r>0.999。

2、采用對(duì)照品進(jìn)行。

3、線性范圍一定要將回收率試驗(yàn)的最高濃度包含進(jìn)去，否則回收率濃度超過線性范圍，缺乏定量依據(jù)，這個(gè)錯(cuò)誤非常常見。

精密度

同一份供試品（樣品）溶液，連續(xù)進(jìn)6次。

1、計(jì)算峰面積RSD<2%，資料中體現(xiàn)7張圖（1張空白，6張樣品液）。

2、進(jìn)資料的圖譜必須采用生產(chǎn)線驗(yàn)證的第1批樣品進(jìn)行。

溶液穩(wěn)定性

與精密度在同一天穿插進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行良好的排序設(shè)置，能共用的圖盡量共用減少工作量。以下時(shí)間點(diǎn)必做（除非已知穩(wěn)定性情況可減少時(shí)間點(diǎn)）。

0、4、6、8、10、12、18、24。

1、實(shí)驗(yàn)過程中可取精密度中的圖作為2h或4h，甚至6h。

2、做7至8個(gè)時(shí)間點(diǎn)，在撰寫申報(bào)資料時(shí)最后以6個(gè)數(shù)據(jù)填報(bào)。

3、溶液穩(wěn)定性數(shù)據(jù)至少做到16h穩(wěn)定（盡量做得更長(zhǎng)時(shí)間，都是自動(dòng)進(jìn)樣，一個(gè)過夜就至少在12小時(shí)以上，時(shí)間太短無法證明溶液穩(wěn)定性），極特殊情況下可以采用低溫進(jìn)樣器或特殊的保存方法或現(xiàn)配現(xiàn)分析等操作，但要求有數(shù)據(jù)作為支持依據(jù)，方可將特殊處理方法定入標(biāo)準(zhǔn)。

4、6個(gè)數(shù)據(jù)計(jì)算峰面積RSD<2%。

重復(fù)性

同一批號(hào)樣品，同一人員同法操作分別稱取2份對(duì)照品及6份供試品（樣品）溶液，各進(jìn)1次。

1、計(jì)算含量RSD<2%，資料中體現(xiàn)9張圖（1張空白，2張對(duì)照，6張樣品）。

2、進(jìn)資料的圖譜必須采用生產(chǎn)線驗(yàn)證的第1批樣品進(jìn)行。

中間精密度

同一批號(hào)樣品，不同人員，不同設(shè)備，同法操作，分別稱取2份對(duì)照品及6份供試品（樣品）溶液，各進(jìn)1次。推薦次日操作，避免產(chǎn)生壓針的疑問（萬一審評(píng)老師沒有注意到設(shè)備編號(hào)，所以別自找麻煩，推薦次日操作）。對(duì)照品也要重新稱取。

與重復(fù)性的6個(gè)數(shù)據(jù)，共同參與統(tǒng)計(jì)，計(jì)算12個(gè)含量數(shù)據(jù)結(jié)果，RSD<2%，資料中體現(xiàn)18張圖，其中重復(fù)性9張，次日數(shù)據(jù)9張（1張空白，2張對(duì)照，6張樣品）。進(jìn)資料的圖譜必須采用生產(chǎn)線驗(yàn)證的第1批樣品進(jìn)行。

準(zhǔn)確度

采用回收率試驗(yàn)方式進(jìn)行，通常采用直接回收率實(shí)驗(yàn)法，按照80%、100%、120%比例分別稱取樣品，同法操作，每個(gè)比例各3份樣品，各進(jìn)1次。

1、以中間精密度的含量均值作為理論含量，計(jì)算回收率，回收率變動(dòng)范圍98%—102%，回收率RSD<2%，資料中體現(xiàn)12張圖（1張空白，2張對(duì)照，9張樣品）。進(jìn)資料的圖譜必須采用生產(chǎn)線驗(yàn)證的第1批樣品進(jìn)行。

2、原料藥采用直接回收率。

3、制劑采用加樣回收率測(cè)定：采用20片或粒制劑單位終產(chǎn)品混合研碎后，按比例稱取進(jìn)行加樣回收，加樣回收率采用80%、100%、120%比例，1:1加入，加樣回收率不能達(dá)標(biāo)時(shí)（輔料有吸附或干擾較大時(shí)），方可采用直接回收率。回收率變動(dòng)范圍98%—102%，回收率RSD<2%，資料中體現(xiàn)12張圖（1張空白，2張對(duì)照，9張樣品）。

耐用性實(shí)驗(yàn)

改變色譜柱

不同品牌的色譜柱，共3個(gè)品牌。比較分離度，保留時(shí)間，含量測(cè)定結(jié)果。

如果品牌不足3個(gè)可采用多個(gè)批號(hào)或不同品牌多個(gè)批號(hào)的方式，不能采用廢柱子進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1、最好在同一天對(duì)倆份樣品溶液和倆份對(duì)照溶液進(jìn)行。

2、3個(gè)品牌的色譜柱共15張圖（每個(gè)色譜柱1張空白，2張對(duì)照，2個(gè)樣品各1張），各條件下的含量數(shù)據(jù)（n=6）的RSD<2%。進(jìn)資料的圖譜必須采用生產(chǎn)線驗(yàn)證的第1批樣品進(jìn)行。

流動(dòng)相比例

流動(dòng)相的低組分比例變化約±5%。

1、最好在同一天對(duì)倆份樣品溶液和倆份對(duì)照溶液進(jìn)行。

2、3個(gè)不同比例的流動(dòng)相15張圖（每個(gè)比例1張空白，2張對(duì)照，2個(gè)樣品各1張），各條件下的含量數(shù)據(jù)（n=6）的RSD<2%。進(jìn)資料的圖譜必須采用生產(chǎn)線驗(yàn)證的第1批樣品進(jìn)行。最優(yōu)標(biāo)準(zhǔn)條件的圖譜每天都要重做，為了避免色譜柱效能下降或引起其他問題無法確認(rèn)。

流速變化

流速±10%。

1、最好在同一天對(duì)倆份樣品溶液和倆份對(duì)照溶液進(jìn)行。

2、3個(gè)不同流速的流動(dòng)相15張圖（每個(gè)比例1張空白，2張對(duì)照，2個(gè)樣品各1張），各條件下的含量數(shù)據(jù)（n=6）的RSD<2%。進(jìn)資料的圖譜必須采用生產(chǎn)線驗(yàn)證的第1批樣品進(jìn)行。最優(yōu)標(biāo)準(zhǔn)條件的圖譜每天都要重做，為了避免色譜柱效能下降或引起其他問題無法確認(rèn)。

不同pH

pH值±0.2

1、最好在同一天對(duì)倆份樣品溶液和兩份對(duì)照溶液進(jìn)行。

2、3個(gè)不同pH的流動(dòng)相15張圖（每個(gè)比例1張空白，2張對(duì)照，2個(gè)樣品各1張），各條件下的含量數(shù)據(jù)（n=6）的RSD<2%。進(jìn)資料的圖譜必須采用生產(chǎn)線驗(yàn)證的第1批樣品進(jìn)行。最優(yōu)標(biāo)準(zhǔn)條件的圖譜每天都要重做，為了避免色譜柱效能下降或引起其他問題無法確認(rèn)。

柱溫

柱溫±5℃

25℃、30℃（或最優(yōu)參數(shù)）、35℃

1、最好在同一天對(duì)倆份樣品溶液和一份對(duì)照溶液進(jìn)行。

2、3個(gè)不同溫度15張圖（每個(gè)比例1張空白，2張對(duì)照，2個(gè)樣品各1張），各條件下的含量數(shù)據(jù)（n=6）的RSD<2%。進(jìn)資料的圖譜必須采用生產(chǎn)線驗(yàn)證的第1批樣品進(jìn)行。最優(yōu)標(biāo)準(zhǔn)條件的圖譜每天都要重做，為了避免色譜柱效能下降或引起其他問題無法確認(rèn)。

0天樣品檢測(cè)

方法學(xué)研究結(jié)束且各項(xiàng)考察數(shù)據(jù)符合要求后，對(duì)3批生產(chǎn)線驗(yàn)證樣品及被仿品在同一天進(jìn)行檢測(cè)。此數(shù)據(jù)在申報(bào)資料產(chǎn)品檢驗(yàn)報(bào)告單中體現(xiàn)，且可作為穩(wěn)定性的0天數(shù)據(jù)。

雙樣雙針。對(duì)照品也為雙樣雙針。