聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制，PCR的最大特點是能將微量的DNA大幅增加。

熒光定量PCR是一種常用的技術(shù)手段，在實驗過程中你都遇到過哪些問題？


   一、沒有Ct值

檢測結(jié)果遇到?jīng)]有Ct值情況，排查是否有以下問題：

1、循環(huán)數(shù)不夠(一般不超過45循環(huán)，不僅背景值提高，定量也不準(zhǔn))；

2、PCR程序設(shè)置錯誤，檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時采集，TaqMan法則一般在退火結(jié)束時或延伸時采集信號，另外熒光采集是否選中；

3、引物或探針降解�？赏ㄟ^PAGE電泳檢測引物和探針是否降解；

4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng，根據(jù)試劑盒說明書即可)， 對未知濃度的樣本應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起；如果發(fā)生模板降解，應(yīng)考慮樣本準(zhǔn)備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況，建議將模板樣本小量分裝儲備，避免反復(fù)凍融；

5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內(nèi)含子，以確保擴增基因組DNA；上下游引物Tm值超過4℃以上也會影響擴增)。

二、Ct值過晚

在相對定量中，Ct值一般控制在15—25之間比較好，如果在絕對定量中對低拷貝數(shù)的樣品，Ct值會增大， 但是一般不宜超過40循環(huán)，否則定量不準(zhǔn)確。

因此，判斷Ct值出現(xiàn)過晚是否屬于非正常情況，需要根據(jù)具體實驗設(shè)計和目的進(jìn)行。

1、擴增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適，需要進(jìn)行優(yōu)化；引物或探針設(shè)計不合理，需要重新設(shè)計；

2、PCR程序不合適，改用三步法進(jìn)行反應(yīng)，或者優(yōu)化退火/延伸溫度，可以適當(dāng)降低退火溫度；退火/延伸時間短(可以在推薦的時間條件下延長10s)；

3、MgCl₂濃度不合適，增加鎂離子濃度等。PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足；

4、PCR產(chǎn)物太長。PCR產(chǎn)物設(shè)計超過500bp；

5、模板中存在抑制物。用高純度模板進(jìn)行PCR檢測或?qū)⒛０暹M(jìn)行稀釋。

三、陰性對照擴增有信號 

排查各操作環(huán)節(jié)是否有不當(dāng)，造成交叉污染：

1、引物設(shè)計不夠優(yōu)化。應(yīng)避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)；

2、引物濃度不佳。適當(dāng)降低引物濃度，并注意上下游引物的濃度配比；

3、鎂離子濃度過高。適當(dāng)降低鎂離子濃度，或選擇更適合的Mix試劑盒；

4、模板有基因組的污染。RNA提取過程中避免基因組DNA的引入，或通過引物設(shè)計避免非特異性擴增；

5、交叉污染。在所用的試劑中有交叉污染，或操作環(huán)境中有氣溶膠造成污染，建議對操作環(huán)境進(jìn)行處理，或者更換新的環(huán)境、加樣器、槍頭以及所有的引物、試劑等。  

四、標(biāo)準(zhǔn)曲線不佳

標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系不佳，R²<0.9，很有可能是以下環(huán)節(jié)存在問題：

1、標(biāo)準(zhǔn)品稀釋或者加樣誤差，使得標(biāo)準(zhǔn)品不呈梯度；

2、標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)降解。應(yīng)避免標(biāo)準(zhǔn)品反復(fù)凍融，將高濃度DNA模板分裝，保存于-20℃或-80℃，現(xiàn)配現(xiàn)用；

3、引物或探針不佳。重新設(shè)計更好更穩(wěn)定的引物或探針；

4、模板中存在抑制物。模板濃度過高，根據(jù)現(xiàn)有商品化熒光定量試劑盒的要求，一般模板量以50—500ng為宜。  

五、熔解曲線峰不特異

熔解曲線峰不特異很有可能是以下環(huán)節(jié)存在問題：

1、引物設(shè)計不夠優(yōu)化。應(yīng)避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)；引物濃度不佳，尤其是涉及二聚體存在時，適當(dāng)降低引物濃度，并注意上下游引物的濃度比例；

2、模板有基因組污染。RNA提取過程中避免基因組DNA的引入，或通過引物設(shè)計避免非特異性擴增；

3、離子濃度不合適。適當(dāng)降低鎂離子濃度，或選擇更適合的mix試劑盒， 不同試劑盒在該方面的優(yōu)化能力不適合，有些情況下可以通過更換試劑盒改善結(jié)果。

六、擴增曲線異常

遇到擴增曲線異常，比如“S”型曲線等等情況，有可能是以下環(huán)節(jié)存在問題：

1、模板的濃度太高或者降解；

2、熒光染料的降解；

3、在操作熒光定量PCR時，帶上新的一次性手套,蓋上避免任何指紋或者字跡等；

4、液體揮發(fā)。耗材氣密性等問題引起液體蒸發(fā)，沒有很好的聚集在管子里；

5、氣泡。操作問題如移液槍加樣引起的氣泡問題。 

七、擴增效率低

該情況適用于針對所有的基因,特別是內(nèi)參基因仍無法獲得較好的擴增信號時,應(yīng)考慮如下情況：

1、反應(yīng)試劑中部分成分比例是否最佳，另外考慮熒光染料是否降解；

2、反應(yīng)條件不夠優(yōu)化。可適當(dāng)降低退火溫度或改為三步擴增法,適當(dāng)延長變性退火時間；

3、反應(yīng)體系中有PCR反應(yīng)抑制物。一般是加入模板時所引入的,應(yīng)先把模板適度稀釋,再加入反應(yīng)體系,減少抑制物的影響。