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在使用“上了年紀”的紫外分光光度計時，我們經(jīng)常會碰到一些讓人頭大的問題。不是光源不亮，就是不能歸零……
這對頭發(fā)本就不“富�！钡目蒲腥藖碚f，更是雪上加霜！為了從根源上減少它故障的頻率，今天我們就全面地了解下紫外分光光度計！（文后附常見問題與解決措施）
紫外分光光度計
紫外分光光度計是廣泛應用于生物、醫(yī)學等多個科學研究領域的儀器之一。紫外分光光度計儀器分析法是利用物質(zhì)分子吸收紫外可見光譜區(qū)輻射的一種儀器分析方法。其基本原理依據(jù)朗伯·比爾定律——光被透明介質(zhì)吸收的比例與入射光的強度無關，光的吸收與吸收層厚度、溶液濃度、光吸收率成正比，可用下式表示：
A=k×b×c
（A為吸光度；k為摩爾吸光系數(shù)；b為光程，即盛放溶液的液槽的透光厚度；c為溶液濃度。）
儀器結(jié)構(gòu)
紫外分光光度計由光源、單色器、吸收池、檢測器和信號顯示系統(tǒng)五大部分組成。
光源：是提供符合要求的入射光的裝置，有熱輻射光源和氣體放電光源兩類。熱輻射光源用于可見光區(qū)，一般為鎢燈和鹵鎢燈，波長范圍是350nm～1000nm；氣體放電光源用于紫外光區(qū)，一般為氫燈和氘燈，連續(xù)波長范圍是180nm～360nm。
單色器：功能是將光源產(chǎn)生的復合光分解為單色光和分出所需的單色光束，它是分光光度計的心臟部分。
吸收池：又稱比色皿，供盛放試液進行吸光度測量之用，其底及兩側(cè)為毛玻璃，另兩面為光學透光面，為減少光的反射損失，吸收池的光學面必須完全垂直于光束方向。根據(jù)材質(zhì)可分為玻璃池和石英池兩種，前者用于可見光光區(qū)測定，后者用于紫外光區(qū)。
檢測器：是將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘柕难b置，測量吸光度時，并非直接測量透過吸收池的光強度，而是將光強度轉(zhuǎn)換為電流信號進行測試，這種光電轉(zhuǎn)換器件稱為檢測器。
信號顯示系統(tǒng)：是將檢測器輸出的信號放大，并顯示出來的裝置。
優(yōu)勢
可重復使用樣品；
可以快速進行測量；
儀器使用操作簡單；
數(shù)據(jù)分析操作簡單；
產(chǎn)品成本、操作成本低。
局限性
雜散光。波長選擇器并不完美，來自寬波長范圍的少量光仍可能從光源傳輸，這可能會導致嚴重的測量錯誤。
光散射。這通常是由液體樣品中的懸浮固體引起的，這可能會導致嚴重的測量誤差。比色皿或樣品中存在的氣泡會散射光，導致無法重現(xiàn)結(jié)果。
來自多個吸收物種的干擾。為了進行適當?shù)亩糠治�，應將每種化學物質(zhì)從樣品中分離出來并單獨檢查。
組件的偏差。任何儀器組件未對準定位，尤其是固定樣品的比色皿，都可能產(chǎn)生不可重復和不準確的結(jié)果。
操作步驟
STEP 1：開機預熱
在儀器測試之前一定要進行預熱，預熱的時間應該大于20min。檢查樣品室中是否有遮光物，有則取出。
STEP 2：光源選擇
電源打開后，鎢燈會亮起。若在波長200nm～290nm之間工作，則光源切換至氘燈；在波長290nm～360nm之間工作，則要同時點亮氘燈和鎢燈。
STEP 3：波長選擇
輸入所需波長。
STEP 4：設備校準
沒有開機自動校準功能的設備需按說明書手動校準。
STEP 5：開始測量
按START鍵開始測量，通常使用裝有蒸餾水的吸收池調(diào)零后放入樣品和參比樣進行測試，并記錄測試結(jié)果。測定前要經(jīng)過預實驗確定合適的樣品濃度，讓反應后的待測溶液的光吸收值位于0.3～0.7之間。否則，待測數(shù)據(jù)不能正確反映實際變化。如果不同樣品之間濃度差異較大，則在測定時應先測定低濃度樣品（淺色），再定測高濃度樣品（深色）。
STEP 6：數(shù)據(jù)處理
定量測試時通常需要先測定若干個已知濃度的待測物標準樣品，根據(jù)其吸光值與濃度繪制標準曲線。
STEP 7：關機
測量完畢后取出吸收池，清洗并晾干后入盒保存。關閉電源，拔下電源插頭，在樣品室內(nèi)放入干燥劑，蓋上樣品室蓋，罩上防塵罩。
常見問題與解決措施
問題1：接通電源后，光源不亮
原因：①保險管燒壞；②光源燈泡損壞。
措施：①更換保險管；②檢查氘燈和鎢燈是否損壞，若損壞則及時更換燈泡。
問題2：吸光值出現(xiàn)負數(shù)
原因：沒做空白對照，樣品吸光值小于空白參比液。
措施：先做空白對照。
問題3：基線某段噪音很高
原因：濾光片受潮發(fā)霉，導致光能量損失嚴重。
措施：更換濾光片。
問題4：吸光值信號上下擺動
原因：開關觸點因長期氧化導致接觸不良。
措施：用金屬活化劑清洗按鍵觸點。
問題5：數(shù)字顯示不能歸零，同時圖線記錄基線位置偏高
原因：①信號處理板可能發(fā)生故障；②光電倍增管等老化，性能降低；③前置放大板出現(xiàn)故障，引起反饋量增大。
措施：①開機通電，先做記錄故障曲線，與原始記錄的標準曲線對照，找出異同點，并做定性定能分析。然后用一只同型號規(guī)格的新光電倍增管替換機上的光電管，再開機實驗，若結(jié)果記錄出來的圖線并沒有什么變化，則證明光電倍增管沒有老化變質(zhì)。②進一步檢查信號處理板各元器件是否損壞，對影響靈敏度有關的電位器進行檢測，看數(shù)據(jù)是否正常。若都正常則說明信號處理板沒有故障。③對以上部件檢查都沒有問題，那么故障很可能發(fā)生在前置級放大板。應采用模擬測試對前置放大板進行測量，先利用直流穩(wěn)壓電源，把各供電電源加上，使其電路單獨工作，把信號發(fā)生器發(fā)出的信號加到輸入端，再用示波器接在輸出端測量輸出信號。將輸入信號與輸出信號對比，若結(jié)果波形相同，說明電路沒有故障。用相同方法對另一個帶驅(qū)動器的開關管進行測量，輸入端加入信號后，示波器若沒有測出輸出端信號，則判斷開關管是損壞的，應換上同一型號規(guī)格的新開關管。
開機前將樣品室內(nèi)的干燥劑取出，儀器自檢過程中禁止打開樣品室蓋。
比色皿內(nèi)溶液以皿高的2/3～4/5為宜，不可過滿以防液體溢出腐蝕儀器。測定時應保持比色皿清潔，池壁上液滴應用擦鏡紙擦干，切勿用手捏透光面。測定紫外波長時，需選用石英比色皿。
測定時，禁止將試劑或液體物質(zhì)放在儀器的表面上，如有溶液溢出或其它原因?qū)悠凡叟K，要盡可能及時清理干凈。
實驗結(jié)束后將比色皿中的溶液倒盡，然后用蒸餾水或有機溶劑沖洗比色皿至干凈，倒立晾干。關掉電源，再將干燥劑放入樣品室內(nèi)，并蓋上防塵罩，做好使用登記。
實驗小百科
紫外分光光度計的發(fā)展歷史可追溯到幾百年前。1852年，Beer參考了Bouguer在1729年和Lambert在1760年所發(fā)表的文章，提出了分光光度的基本定律，即液層厚度相等時，顏色的強度與呈色溶液的濃度成比例，從而奠定了分光光度法的理論基礎，這就是著名的朗伯·比爾定律。1854年，Duboscq和Nessler等人將朗伯·比爾定律應用于定量分析化學領域，并且設計了第一臺比色計。1918年，美國國家標準局制成了第一臺紫外分光光度計。此后，紫外分光光度計經(jīng)過不斷的改進，又出現(xiàn)自動記錄、自動打印、數(shù)字顯示等各種新的功能。這使得分光光度法的靈敏度和準確度不斷提高，應用范圍不斷擴大。
文章來源：網(wǎng)絡
這對頭發(fā)本就不“富�！钡目蒲腥藖碚f，更是雪上加霜！為了從根源上減少它故障的頻率，今天我們就全面地了解下紫外分光光度計！（文后附常見問題與解決措施）
紫外分光光度計
紫外分光光度計是廣泛應用于生物、醫(yī)學等多個科學研究領域的儀器之一。紫外分光光度計儀器分析法是利用物質(zhì)分子吸收紫外可見光譜區(qū)輻射的一種儀器分析方法。其基本原理依據(jù)朗伯·比爾定律——光被透明介質(zhì)吸收的比例與入射光的強度無關，光的吸收與吸收層厚度、溶液濃度、光吸收率成正比，可用下式表示：
A=k×b×c
（A為吸光度；k為摩爾吸光系數(shù)；b為光程，即盛放溶液的液槽的透光厚度；c為溶液濃度。）
儀器結(jié)構(gòu)
紫外分光光度計由光源、單色器、吸收池、檢測器和信號顯示系統(tǒng)五大部分組成。
光源：是提供符合要求的入射光的裝置，有熱輻射光源和氣體放電光源兩類。熱輻射光源用于可見光區(qū)，一般為鎢燈和鹵鎢燈，波長范圍是350nm～1000nm；氣體放電光源用于紫外光區(qū)，一般為氫燈和氘燈，連續(xù)波長范圍是180nm～360nm。
單色器：功能是將光源產(chǎn)生的復合光分解為單色光和分出所需的單色光束，它是分光光度計的心臟部分。
吸收池：又稱比色皿，供盛放試液進行吸光度測量之用，其底及兩側(cè)為毛玻璃，另兩面為光學透光面，為減少光的反射損失，吸收池的光學面必須完全垂直于光束方向。根據(jù)材質(zhì)可分為玻璃池和石英池兩種，前者用于可見光光區(qū)測定，后者用于紫外光區(qū)。
檢測器：是將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘柕难b置，測量吸光度時，并非直接測量透過吸收池的光強度，而是將光強度轉(zhuǎn)換為電流信號進行測試，這種光電轉(zhuǎn)換器件稱為檢測器。
信號顯示系統(tǒng)：是將檢測器輸出的信號放大，并顯示出來的裝置。
優(yōu)勢
可重復使用樣品；
可以快速進行測量；
儀器使用操作簡單；
數(shù)據(jù)分析操作簡單；
產(chǎn)品成本、操作成本低。
局限性
雜散光。波長選擇器并不完美，來自寬波長范圍的少量光仍可能從光源傳輸，這可能會導致嚴重的測量錯誤。
光散射。這通常是由液體樣品中的懸浮固體引起的，這可能會導致嚴重的測量誤差。比色皿或樣品中存在的氣泡會散射光，導致無法重現(xiàn)結(jié)果。
來自多個吸收物種的干擾。為了進行適當?shù)亩糠治�，應將每種化學物質(zhì)從樣品中分離出來并單獨檢查。
組件的偏差。任何儀器組件未對準定位，尤其是固定樣品的比色皿，都可能產(chǎn)生不可重復和不準確的結(jié)果。
操作步驟
STEP 1：開機預熱
在儀器測試之前一定要進行預熱，預熱的時間應該大于20min。檢查樣品室中是否有遮光物，有則取出。
STEP 2：光源選擇
電源打開后，鎢燈會亮起。若在波長200nm～290nm之間工作，則光源切換至氘燈；在波長290nm～360nm之間工作，則要同時點亮氘燈和鎢燈。
STEP 3：波長選擇
輸入所需波長。
STEP 4：設備校準
沒有開機自動校準功能的設備需按說明書手動校準。
STEP 5：開始測量
按START鍵開始測量，通常使用裝有蒸餾水的吸收池調(diào)零后放入樣品和參比樣進行測試，并記錄測試結(jié)果。測定前要經(jīng)過預實驗確定合適的樣品濃度，讓反應后的待測溶液的光吸收值位于0.3～0.7之間。否則，待測數(shù)據(jù)不能正確反映實際變化。如果不同樣品之間濃度差異較大，則在測定時應先測定低濃度樣品（淺色），再定測高濃度樣品（深色）。
STEP 6：數(shù)據(jù)處理
定量測試時通常需要先測定若干個已知濃度的待測物標準樣品，根據(jù)其吸光值與濃度繪制標準曲線。
STEP 7：關機
測量完畢后取出吸收池，清洗并晾干后入盒保存。關閉電源，拔下電源插頭，在樣品室內(nèi)放入干燥劑，蓋上樣品室蓋，罩上防塵罩。
常見問題與解決措施
問題1：接通電源后，光源不亮
原因：①保險管燒壞；②光源燈泡損壞。
措施：①更換保險管；②檢查氘燈和鎢燈是否損壞，若損壞則及時更換燈泡。
問題2：吸光值出現(xiàn)負數(shù)
原因：沒做空白對照，樣品吸光值小于空白參比液。
措施：先做空白對照。
問題3：基線某段噪音很高
原因：濾光片受潮發(fā)霉，導致光能量損失嚴重。
措施：更換濾光片。
問題4：吸光值信號上下擺動
原因：開關觸點因長期氧化導致接觸不良。
措施：用金屬活化劑清洗按鍵觸點。
問題5：數(shù)字顯示不能歸零，同時圖線記錄基線位置偏高
原因：①信號處理板可能發(fā)生故障；②光電倍增管等老化，性能降低；③前置放大板出現(xiàn)故障，引起反饋量增大。
措施：①開機通電，先做記錄故障曲線，與原始記錄的標準曲線對照，找出異同點，并做定性定能分析。然后用一只同型號規(guī)格的新光電倍增管替換機上的光電管，再開機實驗，若結(jié)果記錄出來的圖線并沒有什么變化，則證明光電倍增管沒有老化變質(zhì)。②進一步檢查信號處理板各元器件是否損壞，對影響靈敏度有關的電位器進行檢測，看數(shù)據(jù)是否正常。若都正常則說明信號處理板沒有故障。③對以上部件檢查都沒有問題，那么故障很可能發(fā)生在前置級放大板。應采用模擬測試對前置放大板進行測量，先利用直流穩(wěn)壓電源，把各供電電源加上，使其電路單獨工作，把信號發(fā)生器發(fā)出的信號加到輸入端，再用示波器接在輸出端測量輸出信號。將輸入信號與輸出信號對比，若結(jié)果波形相同，說明電路沒有故障。用相同方法對另一個帶驅(qū)動器的開關管進行測量，輸入端加入信號后，示波器若沒有測出輸出端信號，則判斷開關管是損壞的，應換上同一型號規(guī)格的新開關管。
開機前將樣品室內(nèi)的干燥劑取出，儀器自檢過程中禁止打開樣品室蓋。
比色皿內(nèi)溶液以皿高的2/3～4/5為宜，不可過滿以防液體溢出腐蝕儀器。測定時應保持比色皿清潔，池壁上液滴應用擦鏡紙擦干，切勿用手捏透光面。測定紫外波長時，需選用石英比色皿。
測定時，禁止將試劑或液體物質(zhì)放在儀器的表面上，如有溶液溢出或其它原因?qū)悠凡叟K，要盡可能及時清理干凈。
實驗結(jié)束后將比色皿中的溶液倒盡，然后用蒸餾水或有機溶劑沖洗比色皿至干凈，倒立晾干。關掉電源，再將干燥劑放入樣品室內(nèi)，并蓋上防塵罩，做好使用登記。
實驗小百科
紫外分光光度計的發(fā)展歷史可追溯到幾百年前。1852年，Beer參考了Bouguer在1729年和Lambert在1760年所發(fā)表的文章，提出了分光光度的基本定律，即液層厚度相等時，顏色的強度與呈色溶液的濃度成比例，從而奠定了分光光度法的理論基礎，這就是著名的朗伯·比爾定律。1854年，Duboscq和Nessler等人將朗伯·比爾定律應用于定量分析化學領域，并且設計了第一臺比色計。1918年，美國國家標準局制成了第一臺紫外分光光度計。此后，紫外分光光度計經(jīng)過不斷的改進，又出現(xiàn)自動記錄、自動打印、數(shù)字顯示等各種新的功能。這使得分光光度法的靈敏度和準確度不斷提高，應用范圍不斷擴大。
文章來源：網(wǎng)絡
