The Merrifield的固相肽合成始于1960年代, 在1980年代中期在多種平行固相合成中得到復(fù)興. Geysen 發(fā)展了一種利用多針 和標(biāo)準(zhǔn)96孔圓片一次合成96種肽的方法, Houghten 引入了茶袋法. 1990年代早期, 提出了單珠單化合物概念, 合成了一個(gè)高度混合文庫(kù)結(jié)合了子文庫(kù)和重疊合法(deconvolution). 另一方面, 被用作半導(dǎo)體工業(yè)中的標(biāo)準(zhǔn)方法的照相平版技術(shù) 也被應(yīng)用于文庫(kù)合成.
多針法
96個(gè)聚乙烯針排列于標(biāo)準(zhǔn)96孔圓片上, 每個(gè)針的末端賦以反應(yīng)用的官能團(tuán). 每個(gè)孔包含活化的氨基酸溶液, 針被浸于溶液中以進(jìn)行肽偶聯(lián)反應(yīng); 每個(gè)反應(yīng)孔將產(chǎn)生不同的肽產(chǎn)物. 這種方法大約能產(chǎn)生0.05-2 mmol的肽.
微量滴定圓片多針
茶袋法
帶有小孔的聚乙烯袋, 與實(shí)際的茶袋非常相似, 里面填充樹脂珠且每個(gè)袋子置于不同的反應(yīng)器皿中以完成氨基酸偶聯(lián)反應(yīng). 反應(yīng)后, 收集所有的袋子一齊做去保護(hù)基反應(yīng)并洗去樹脂珠以節(jié)省時(shí)間. 在本方法中, 袋子起到了濾紙的作用并防止了不同反應(yīng)間樹脂珠的混和, 而且通過標(biāo)記袋子, 合成的肽結(jié)構(gòu)可被識(shí)別. 大約有500mmol的100種不同的肽可用此法合成, 這是平行合成的實(shí)際方法證明, 盡管合成的肽種類不是很多.
重疊合法(Deconvolution)
有幾種不同的方法可被用于重疊合法 , 一個(gè)例子如下. 如果用20種氨基酸制得5-mer的肽文庫(kù)(全部可能組合數(shù)為205 = 3,200,000), 第一個(gè)氨基酸以及其余4個(gè)都將會(huì)從20種氨基酸中隨機(jī)抽取. 在這些20套肽混合物(每個(gè)包含204 = 160,000 種肽)中, 最具活性的混合物將通過篩選而得到. 在第二輪中, 肽的1位將賦為第一輪篩選出的最具活性的, 2位將從20種氨基酸中選擇, 其余3個(gè)位置隨機(jī)選擇. 這些20肽混合物將包含203 = 8,000 種肽, 第二輪篩選將決定2位最具活性的氨基酸. 按照類似的過程, 重復(fù)3遍后找到最有活性的分子. 這種方法將使篩選100個(gè)反應(yīng)(20 每輪 x 5 輪)制得的300萬(wàn)余種化合物成為可能. 盡管這種方法對(duì)于液相及固相化學(xué)都可行, 因?yàn)樽詣?dòng)化所帶來的易處使得固相肽合成及從載體上切割下來然后篩選的技術(shù)更為廣泛應(yīng)用. 由于溶液中的分子是自由的, 可供選擇的篩選方式較固相載體束縛的肽更為寬泛. 雖然如此, 篩選的最初階段所給出的混合物(例如160,000)中含有太多種分子, 因而活性組分的濃度太低而不易與噪聲相區(qū)別. 一個(gè)改進(jìn)的方法是固定以20種氨基酸固定一個(gè)位置并令其他4個(gè)位置隨機(jī)然后篩選; 所有的子文庫(kù)將包含160,000種肽混合物. 經(jīng)過5輪篩選, 給出最優(yōu)的選擇.
隨機(jī)合成肽混合物的一個(gè)重要方面是在一個(gè)位置上引入相同量的20種氨基酸. 如果不是這樣, 產(chǎn)生的文庫(kù)的相對(duì)量將會(huì)隨不同氨基酸的反應(yīng)活性而改變, 最后干擾正常的篩選. 依靠側(cè)鏈的性質(zhì), 氨基酸的反應(yīng)活性可被單獨(dú)測(cè)量, 而且一個(gè)互惠(對(duì)反應(yīng)活性而言)量的氨基酸應(yīng)該被混合以產(chǎn)生等量的混合物.
照相平版
照相平版術(shù)包括光敏保護(hù)基和石版印刷術(shù), 在半導(dǎo)體工業(yè)中是一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的工具, 在平行合成中有所應(yīng)用. 在這個(gè)方法中, 每個(gè)文庫(kù)化合物被放置在一枚芯片上, 而且反應(yīng)歷程(因此最后的產(chǎn)品結(jié)構(gòu))將會(huì)依空間的地址識(shí)別. 隨著半導(dǎo)體技術(shù)的進(jìn)步, 清晰度令人驚異的增加從而在一枚小芯片上提供數(shù)百乃至數(shù)千化合物. 現(xiàn)在, 芯片技術(shù)被用于肽或核苷低聚物的合成, 后者發(fā)展以至進(jìn)入DNA芯片和基因芯片.
這里舉肽合成為例. 芯片的玻璃表面用化學(xué)方法修飾而產(chǎn)生用光敏基團(tuán)保護(hù)的氨基. 預(yù)先設(shè)計(jì)的掩膜覆蓋到芯片上, 然后使光射到需要反應(yīng)的位置上而除掉保護(hù)基從而暴露出氨基. 整個(gè)芯片置于反應(yīng)釜中然后吸附氨基酸A到暴露的區(qū)域. 使用不同的掩膜, 暴露光到第二區(qū)域, 使氨基酸B在那里偶聯(lián). 如被引入的氨基酸也被光敏基團(tuán)保護(hù), 在完成第一層合成后, 上層合成可被重復(fù)以達(dá)到目標(biāo)大小.
螢光標(biāo)記的抗體或受體將會(huì)被加在這枚合成物質(zhì)芯片表面, 然后依據(jù)鍵能, 得到螢光圖案. 讀取螢光位置的芯片地址將會(huì)識(shí)別出標(biāo)記蛋白的鍵合雙方的結(jié)構(gòu). 分辨率越高, 識(shí)別螢光信號(hào)并比較強(qiáng)度就越需要自動(dòng)化完成.
