摘要
制作芯片和獲得芯片的數(shù)據(jù)有許多不同的方法。這里我們介紹了在學(xué)術(shù)領(lǐng)域中兩種芯片的構(gòu)建和使用。除了詳細(xì)說(shuō)明了技術(shù)細(xì)節(jié)外，我們還對(duì)組成和方法的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了評(píng)論，同時(shí)還介紹了雜交的方法。用我們所建立和使用芯片的方法來(lái)回答生物領(lǐng)域問(wèn)題的事實(shí)證明了這種技術(shù)在大學(xué)的環(huán)境下是可行的。
一種獲得基因功能信息的高通量的方法是cDNA芯片。在一塊顯微鏡載玻片上包含了幾百至幾千個(gè)固定的DNA樣本，以類似于Northern blot 和 Southern blot的方法進(jìn)行雜交。了解了這個(gè)方法后，我們決定在我們各自的實(shí)驗(yàn)室Pennsylvania大學(xué)（Penn）和Albert Einstein學(xué)院醫(yī)學(xué)部（AECOM）制作了高速，高精度的芯片。這個(gè)設(shè)備是由Stanford醫(yī)學(xué)院Pat Brown制造的，第一次論證了這個(gè)方法的可行性。我們的目標(biāo)是（1）最終以合理的價(jià)格，用一塊或幾塊芯片來(lái)檢測(cè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中每個(gè)基因的表達(dá)，（2）發(fā)展以芯片為基礎(chǔ)的繪圖方法，（3）兼顧硬件和超作方法，盡可能地提高靈敏度。
玻片的優(yōu)勢(shì)
一個(gè)理想化的支持物允許探針有效地固定在其表面，探針與目標(biāo)分子能牢固地雜交結(jié)合。與另一種用于制作芯片的標(biāo)準(zhǔn)支持物尼龍一樣，玻璃有許多的優(yōu)點(diǎn)。它也有其特長(zhǎng)。首先，DNA樣品以共價(jià)鍵的形式結(jié)合在處理過(guò)的玻片上。第二，玻璃是一種耐用的材料，能夠耐高溫和高離子強(qiáng)度溶液的洗滌。第三，玻璃不是多孔材料，使雜交的容量能保持在最小，因此能提高探針與目標(biāo)分子的退火效率。第四，由于材料的低熒光性，不會(huì)有背景的影響。最后，兩種不同的探針能夠標(biāo)上兩種不同的熒光標(biāo)記，在一片芯片上同一個(gè)反應(yīng)中同時(shí)孵育；尼龍就受到連續(xù)或平行雜交的限制。
芯片需要大量的探針固定（或排列）在玻片上，這里我們描述了AECOM芯片，掃描儀以及進(jìn)行了關(guān)于設(shè)計(jì)和操作的討論。如果想得到關(guān)于Penn芯片的信息，請(qǐng)到http://w95vcl.neuro.chop.edu/vcheung查找。
自動(dòng)化裝置性質(zhì)
AECOM點(diǎn)樣儀，Albert，產(chǎn)生高密度的分隔的矩陣，矩陣包括cDNA、基因組DNA或其他類似的生物物質(zhì)。機(jī)械的基本組成有計(jì)算機(jī)控制的三軸向的機(jī)械手和獨(dú)特筆尖裝置。
設(shè)計(jì)特點(diǎn)
機(jī)械手被設(shè)計(jì)成能自動(dòng)從96或384孔的微量滴定板中選取樣本，12支點(diǎn)樣筆同時(shí)升起，每個(gè)點(diǎn)樣筆收集了250-500nl溶液，在每塊玻片上放置0.25-1nl，產(chǎn)生的點(diǎn)的大小范圍直徑為100-150μm。機(jī)械手是由設(shè)置好的程序控制的，能進(jìn)行連續(xù)的點(diǎn)樣，每一點(diǎn)避免與相鄰的點(diǎn)接觸，每點(diǎn)的中心距離大約為200-250μm。檢測(cè)的精密度大約是10μm。機(jī)械手放置在可視工作平臺(tái)上（Newport公司），允許放置大量的顯微鏡玻片，微量滴定板，三個(gè)洗滌裝置和一個(gè)干燥裝置。
洗滌裝置是個(gè)固定的容器，裝有蒸餾水，兩次微量滴定板使用后需要更換。當(dāng)筆尖浸過(guò)液體后，機(jī)械手要來(lái)回?fù)u動(dòng)點(diǎn)樣筆（大約5Hz）來(lái)增加清潔程度。雖然我們認(rèn)為沒(méi)必要，但電腦控制的洗滌液可用超聲波或流動(dòng)的水來(lái)替代。干燥裝置實(shí)際上是干/濕真空吸塵器（Sear公司，美國(guó)），接頭與插入筆尖的限制插口相匹配。干燥器要做到在筆尖有快速流動(dòng)的空氣圍繞，保持局部真空。
所設(shè)計(jì)的機(jī)械手的重要目的是要達(dá)到在最小的震動(dòng)范圍內(nèi)的高速和高精確性。我們使用了保濕的可視工作平臺(tái)，精密螺旋驅(qū)動(dòng)地機(jī)械滑動(dòng)，高分辨率的解碼器的隨動(dòng)系統(tǒng)和沿著x軸方向的兩側(cè)支桿，避免了在一些系統(tǒng)中所見(jiàn)的懸臂結(jié)構(gòu)。利用第二x軸的滑面來(lái)增加系統(tǒng)的固定性，能依次產(chǎn)生更快的定位以及通過(guò)工作平臺(tái)的準(zhǔn)確一致性。這些特點(diǎn)允許在精確率下的快速運(yùn)動(dòng)，使機(jī)械手能在一秒內(nèi)對(duì)兩塊顯微鏡載玻片操作。
帶有筆尖的點(diǎn)樣筆支持物裝置是一個(gè)重要的部分。我們的設(shè)計(jì)結(jié)合了線形運(yùn)動(dòng)，控制點(diǎn)樣筆的方向，允許在最小的阻力下精確地縱軸運(yùn)動(dòng)，以防止在其他方向上的錯(cuò)位。我們?cè)O(shè)計(jì)的另一個(gè)獨(dú)特之處是可調(diào)整的末端絲，允許在10μm的范圍內(nèi)校直每個(gè)點(diǎn)樣筆的軸，以保證所有12支筆尖能在同一時(shí)間內(nèi)接觸顯微鏡玻片。而另一個(gè)沒(méi)有這特點(diǎn)的設(shè)計(jì)需要與點(diǎn)樣筆的精確長(zhǎng)度一致以適應(yīng)多點(diǎn)樣筆的操作。每個(gè)點(diǎn)樣筆由低強(qiáng)度的彈簧作為支持，保證在未接觸表面時(shí)能回到伸展的位置。筆尖是由直徑大約為1.6mm的不銹鋼材料逐漸處理變細(xì)直至每點(diǎn)直徑為100μm。再沿著中心垂直切割，在尖端分成兩部分，每部部分5μm。
這個(gè)系統(tǒng)由可視基礎(chǔ)程序控制的，在Microsoft Windous NT環(huán)境下運(yùn)行，軟件提供：印刷程序具體化；完成系統(tǒng)校正；顯示真正地時(shí)間位置、速度和產(chǎn)生的錯(cuò)誤；與其他功能參數(shù)一樣重要的隨動(dòng)系統(tǒng)；動(dòng)態(tài)地顯示打印過(guò)程中的重要參數(shù)。隨動(dòng)系統(tǒng)控制的計(jì)算機(jī)中的插件能夠動(dòng)態(tài)地控制高速、復(fù)雜的機(jī)械手的動(dòng)力，并設(shè)計(jì)成以它的運(yùn)動(dòng)來(lái)控制程序的語(yǔ)言�？梢曉砗碗S動(dòng)插件運(yùn)動(dòng)控制程序相互作用，交換了參數(shù)、圖象和所需的命令。微量滴定板的同一性是由掃描它的閱讀器所決定的。由于有筆尖易被灰塵和纖維阻礙的問(wèn)題，打印機(jī)現(xiàn)在被附上了軟保護(hù)壁允許三個(gè)方向的隨意進(jìn)入并且合并了高效率效式空氣過(guò)濾與吹風(fēng)機(jī)以達(dá)到濕氣的再流通。
操作
打印的第一步是將顯微鏡載載玻片以統(tǒng)一的形式排列在工作平臺(tái)上，用在激光平臺(tái)上的1孔作為引導(dǎo)，然后按下。膜微量滴定板固定器突然定位在平臺(tái)的某一位置，用同樣的孔來(lái)排列自己。同樣的微量滴定板固定器保持在沖洗狀態(tài)，也能被放置在任何方便的位置。使用者可任意選擇保留的配置或進(jìn)入配置中的參數(shù)。緩慢移動(dòng)模式用于校驗(yàn)，使坐標(biāo)位置正確。最后，使用者提示增加微量滴定板，機(jī)械手進(jìn)入自動(dòng)點(diǎn)樣操作。點(diǎn)樣筆從微量滴定板中收集樣品并點(diǎn)樣，從而對(duì)每塊載玻片進(jìn)行同樣的操作。然后沖洗/干燥操作，再對(duì)新的樣品進(jìn)行重復(fù)操直到當(dāng)所有的樣品全部完成。在點(diǎn)樣的過(guò)程中，程序自動(dòng)地將同一來(lái)源的微量滴定板保留在磁盤(pán)上，優(yōu)化每一點(diǎn)以及載玻片上的X-Y終點(diǎn)位置。這個(gè)文件稍后與基因說(shuō)明文件合并，產(chǎn)生載玻片上已印好的點(diǎn)的復(fù)合說(shuō)明。
觀察
點(diǎn)大小的精確性依賴著筆尖的規(guī)格。尖端精細(xì)的槽口要求特殊的微加工工具就象Wire EDM。我們用的筆尖是TeleChem的，與我們的筆軸相匹配。它們的性能是可接受的，雖然它們是十分脆的。我們希望能獲得有進(jìn)展，更耐用的樣式。
掃描儀特點(diǎn)
我們?cè)O(shè)計(jì)和制造的激光掃描儀IRIS，是Standford大學(xué)和國(guó)家健康研究所研制的器械的衍生產(chǎn)品，使靈敏度和動(dòng)態(tài)范圍最大化。我們也試圖將運(yùn)轉(zhuǎn)的適應(yīng)程度結(jié)合到設(shè)計(jì)中，因此在將來(lái)能夠進(jìn)行改進(jìn)，允許更有效的熒光染料的測(cè)定（最近引進(jìn)了DNA自動(dòng)測(cè)序儀）。兩個(gè)有染料標(biāo)記的目標(biāo)雜交后，玻片被掃描后產(chǎn)生16位TIF圖象。每點(diǎn)的象素強(qiáng)度是與染料分子的數(shù)量以及與PCR產(chǎn)物斑點(diǎn)雜交探針數(shù)量成比例。
設(shè)計(jì)特點(diǎn)
激光掃描儀有一些關(guān)鍵的組成。軟件是與HPVEE繪圖程序語(yǔ)言同步的程序。規(guī)劃圖形的運(yùn)動(dòng)，控制A/D轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)的捕獲，處理兩個(gè)頻道的信號(hào)，顯示每一次掃描的真實(shí)的時(shí)間參數(shù)，產(chǎn)生TIF文件的標(biāo)題以及保存TIF圖象的結(jié)果。八個(gè)樣本引進(jìn)的數(shù)據(jù)平均為每一個(gè)象素，轉(zhuǎn)換為二進(jìn)制整數(shù)，為校正圖象的變化，輪流進(jìn)行的掃描，然后保存。使用者可以看見(jiàn)大屏幕的示波境波形就是每次掃描的平均值，最小值和最大值統(tǒng)計(jì)。
操作
自動(dòng)化分級(jí)操作搜索掃描模式，在X軸的方向上連續(xù)地通過(guò)顯微鏡載玻片，然后在Y軸的方向上移動(dòng)一個(gè)象素的位置，產(chǎn)生一個(gè)bi-方向的光柵模式。X軸的信號(hào)解碼器是由特殊設(shè)計(jì)的觸發(fā)回路處理的，取消了每次掃描后的隨動(dòng)震動(dòng)，產(chǎn)生了在所有方向上的A/D轉(zhuǎn)換的清晰觸發(fā)�；芈繁ＷC了微米以下的空間分辨率和圖象的線性結(jié)構(gòu)。兩條激光光柱合成聯(lián)合直線，通過(guò)雙重光束分割濾波器反射過(guò)目標(biāo)，形成刺激顯微鏡載玻片上染料分子發(fā)熒光的精細(xì)聚焦光束。部分熒光是由目標(biāo)分子捕獲的，通過(guò)雙光分裂濾波器發(fā)送，在濾波立方中分成紅綠兩種信號(hào)，在波段通過(guò)器中過(guò)濾。發(fā)送入各自的轉(zhuǎn)換電信號(hào)的光電管（PMT0）中。每個(gè)光電管被A/D轉(zhuǎn)換器放大，過(guò)濾和采樣。轉(zhuǎn)換器完成8個(gè)附加抽樣，軟件達(dá)到平均每象素8個(gè)樣本，產(chǎn)生真實(shí)的16位分辨率的圖象。
觀察
我們最初獲得了不恰當(dāng)?shù)男旁氡�，因此制定了雙成分過(guò)濾器，（根據(jù)濃度）建立了我們規(guī)格，降低DC成分的干擾水平。立體過(guò)濾成分的去除，進(jìn)一步改進(jìn)了靈敏度。我們?cè)鹊脑O(shè)計(jì)有包括兩個(gè)相配的聚焦鏡的立體過(guò)濾器，小孔和不同的元件，這些如果組合在一起形成了共焦顯微鏡。但是我們發(fā)現(xiàn)光學(xué)共焦不能加強(qiáng)檢測(cè)。事實(shí)上，鏡頭使干擾水平增加了兩倍，這是由于自動(dòng)的熒光性-整個(gè)裝備導(dǎo)致了所需信號(hào)相當(dāng)大的衰減，結(jié)果所有信噪比大大地減弱。我們因此推斷在X軸方向的立體過(guò)濾在應(yīng)用中沒(méi)有起到作用。我們發(fā)現(xiàn)激光輸出的清晰過(guò)濾對(duì)降低干擾是基本的。最后，為了達(dá)到可視成分的精細(xì)排列和精確的最佳聚焦，利用了刻度載玻片和軟件，獲得了高靈敏度的雙物鏡系統(tǒng)和廣大的動(dòng)態(tài)視野范圍。
有時(shí)遇到的問(wèn)題是鏡子干擾的存在，由十分明亮但比我們所需的點(diǎn)的圖象要小（<1μm-25μm）的信號(hào)組成。我們認(rèn)為這是由于灰塵和沒(méi)結(jié)合的染料所形成的。在干凈的環(huán)境中操作，嚴(yán)格遵守雜交程序?qū)p少這些影響是十分必要的。
在屏幕上顯示的波形是可重復(fù)的。當(dāng)比較同一行的重復(fù)掃描，我們發(fā)現(xiàn)極好的重復(fù)性。從中我們降低了由于掃描儀的光學(xué)和電子學(xué)因素而沒(méi)傳入的有用信號(hào)所產(chǎn)生的變形。當(dāng)調(diào)節(jié)不同的控制參數(shù)時(shí)，這個(gè)顯示能力也使我們精確地測(cè)量了在信號(hào)-干擾率上的影響。PMT冷卻是包括在保持電子干擾最小化的設(shè)計(jì)中的。迄今為止，當(dāng)PMT冷卻到-18℃時(shí)，我們還沒(méi)有找到在提高靈敏度方面的巨大進(jìn)展。系統(tǒng)的干擾水平還沒(méi)有達(dá)到電子干擾的水平，它的重要元件仍舊有光學(xué)干擾�？赡苁请s交進(jìn)程中在載玻片上留下了一些自動(dòng)顯示熒光的殘余。我們正開(kāi)發(fā)新的方法來(lái)進(jìn)一步減少干擾水平。
從目前系統(tǒng)的靈敏性來(lái)看，10 mW激光的能量看來(lái)是足夠的，5mW就能產(chǎn)生令人滿意的結(jié)果，并且顯示了在這個(gè)區(qū)域中系統(tǒng)的增進(jìn)是直線的。PMT的電壓和激光能量是可交換的，不需要降低信號(hào)-干擾率。
性能
比較掃描儀的性能，通常沒(méi)有可接受的標(biāo)準(zhǔn)。為了測(cè)定我們掃描儀的性能，通過(guò)利用一些包含不同濃度Cye3染料校準(zhǔn)的載玻片來(lái)測(cè)定靈敏性。結(jié)果顯示掃描儀能可靠地測(cè)定在100μm點(diǎn)上少于10-18 摩爾的染料的濃度。我們?cè)噲D實(shí)現(xiàn)對(duì)染料結(jié)合和雜交能力測(cè)定的附加實(shí)驗(yàn)，但是性能顯示我們用目前的探針預(yù)備方法能探測(cè)到低量的mRNA。初步的結(jié)果顯示我們的掃描儀有比市場(chǎng)上的掃描儀高四倍的靈敏度，同時(shí)能處理多三倍的信號(hào)（在飽和狀態(tài)前）。我們的掃描儀有超過(guò)1000倍的動(dòng)態(tài)范圍，明顯比高密度過(guò)濾器的10倍的動(dòng)態(tài)范圍要好。我們能同時(shí)進(jìn)行雙色成像，但是是有限制的，因?yàn)橛袃蓚�(gè)通道之間的干擾。這能通過(guò)在一個(gè)時(shí)間掃描一種顏色的方法而最小化，雖然當(dāng)每塊載玻片用兩種以上的染料時(shí)，交叉激發(fā)仍能產(chǎn)生干擾現(xiàn)象。由我們的系統(tǒng)產(chǎn)生的典型的芯片，掃描用典型的12.8μm的象素大小，能產(chǎn)生16位分辨率的2048 by 1550象素的圖象。每個(gè)點(diǎn)覆蓋了大約100個(gè)象素，成像的掃描時(shí)間大約是40分鐘。
雜交注意事項(xiàng)
DNA的數(shù)量。芯片上每點(diǎn)DNA的數(shù)量是可估計(jì)的。猜想每點(diǎn)堆積的形狀是半球形的，它的容量是可以計(jì)算的：
一點(diǎn)的量=1/2 × (4/3πr3 )
每點(diǎn)的DNA的數(shù)量=樣本的濃度 × 每點(diǎn)的量
斑點(diǎn)的容量少意味著用于雜交的探針的數(shù)量也很少，即使樣本的濃度很高。必須努力減少這樣的限制。一些因素必須考慮到，除了探針DNA的數(shù)量外，還有與目標(biāo)分子相互補(bǔ)的探針DNA的比例，長(zhǎng)短，目標(biāo)分子的活性，就象用于檢測(cè)信號(hào)方法的靈敏度影響著信號(hào)的強(qiáng)度。
雜交信號(hào)的濃度是與目標(biāo)分子活性成比例的，與它的長(zhǎng)度成反比，因此目標(biāo)分子的特殊活性是十分重要的。每次實(shí)驗(yàn)的雜交時(shí)間也應(yīng)該精確測(cè)量。
沉積機(jī)制
點(diǎn)樣筆的精確切口允許利用毛細(xì)現(xiàn)象從微量滴定板中吸取樣本。壓力由點(diǎn)樣筆向下的運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生，載玻片的表面張力拖動(dòng)樣本從切口內(nèi)到玻片上。點(diǎn)的大小依賴于點(diǎn)樣筆向下及離開(kāi)載玻片的加速度和載玻片表面的張力。點(diǎn)樣筆向玻片的加速度與點(diǎn)的大小成比例，因此能調(diào)整到所希望的點(diǎn)的大小。當(dāng)點(diǎn)樣筆從玻片收回后，在切口內(nèi)的樣品和沉積在載玻片上的樣本之間的流量就形成了。如果收回的速度很快尖端的量就被打斷了，產(chǎn)生了大的點(diǎn)，不是完美的半球形。如果收回的速度十分慢，點(diǎn)樣量就在尖端"修剪"了，留下的點(diǎn)就小。
DNA樣本
樣本準(zhǔn)備在96孔的板上，乙醇沉淀并用70%的乙醇洗滌,然后在2×檸檬酸鈉（SSC）中重建。樣本濃度的重建依賴于所需點(diǎn)的大小和樣本的粘稠度。如果樣本需要排列為小的點(diǎn)，它們的濃度就要高。但是，限制因素是筆尖的設(shè)計(jì)，會(huì)使樣本粘稠而難以排列，那些濃度大于2μg/μl的太粘了而不能點(diǎn)樣。我們點(diǎn)樣的目標(biāo)濃度是每個(gè)樣本15ng一個(gè)點(diǎn)。雖然我們?cè)?SSC中重新建立了樣本，但是溶液的離子濃度能在1×SSC到5×SSC之間而不影響雜交，然而樣本溶解在溶液中后離子濃度高于5×SSC就很難與載玻片接觸。
將DNA固定到玻璃片
在DNA排列到玻片上以后，它們是自然干燥的。樣本的固定是通過(guò)紫外線（UV）固定的，形成在DNA上的胸腺嘧啶脫氧核苷殘基和硅烷玻片上氨基之間的共價(jià)鍵。類似的方法也用于將DNA樣本固定在尼龍膜上。為了完成最大化的雜交，要在紫外線交聯(lián)之前，芯片要保持微量的濕潤(rùn)，通過(guò)將"排列"暴露在沸水中，然后在254nm的紫外線下暴露到0.27J/cm2 。我們發(fā)現(xiàn)精密測(cè)量照射的量是十分有利的，只要確定產(chǎn)生最佳信號(hào)的照射最佳水平。過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的照射導(dǎo)致了由于連接不充分而產(chǎn)生的DNA損失和個(gè)別地，DNA樣本的過(guò)多的斷裂。在交聯(lián)后，過(guò)多的DNA分子在室溫下被0.1%的SDS沖洗掉，然后在雜交以前，排列的樣本在95℃的水中變性。
雜交中的
有許多方法使目標(biāo)分子和探針進(jìn)行雜交。我們發(fā)現(xiàn)三個(gè)工作溶液對(duì)于熒光探針和固定在玻璃上的DNA的雜交是很好的；與溶劑和溫度不相關(guān)。一般來(lái)說(shuō)，在42℃，甲酰胺基礎(chǔ)上的雜交比65℃水溶液中的要好，因?yàn)榇龠M(jìn)了信號(hào)和雜質(zhì)的比率。但在甲酰胺中的動(dòng)態(tài)雜交要比在水溶液中的慢，當(dāng)用低拷貝量的目標(biāo)分子時(shí)，建議使用有右旋糖苷硫酸鹽或聚乙烯乙二醇的水溶液。
類似的方法用于使"雜質(zhì)"最小化：用Denhardt試劑，十二烷基硫酸鈉（SDS）修剪鮭精DNA，tRNA和Cot1DNA。當(dāng)我們用cDNA時(shí)，也包括多聚A RNA或與富含T的序列相連接的多聚A。
討論
我們集體的努力顯示了在學(xué)術(shù)環(huán)境下如何實(shí)現(xiàn)芯片技術(shù)的。在AECOM，芯片和掃描儀是由家庭工程師制造的，使用家庭工程師的好處是她/他是親手改良和維修儀器的。在Pennsylvania大學(xué)，芯片是在大學(xué)機(jī)械店的幫助下在實(shí)驗(yàn)室中制造的；掃描儀（General掃描儀公司）是購(gòu)買(mǎi)的。
芯片構(gòu)建的改良技術(shù)必須與基因組克隆圖譜實(shí)用性的增加，好的cDNA克隆，分析工具的良好使用相匹配。這些工具的綜合和易操作性對(duì)基因研究發(fā)展的速度是十分重要的。
