1 從37℃培養(yǎng)16～20h的新鮮平板中挑取一個(gè)單菌落（如大腸桿菌DH52），或1ml新鮮的16～20h過(guò)夜培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)到一個(gè)含有100mlLB培養(yǎng)基的1L或500ml培養(yǎng)瓶中。
于37℃振搖培養(yǎng)約2～3h（旋轉(zhuǎn)搖床200～300r/min），每隔20～30min測(cè)量OD600值≈0.4。
2．在無(wú)菌條件下將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個(gè)，用冰預(yù)冷的50ml聚丙烯離心管中，冰上放置10～20min；
3 于4℃4000轉(zhuǎn) /分離心10min，回收細(xì)菌細(xì)胞；
4 將管倒置1min，以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡；
5 以10ml用冰預(yù)冷的0.1mMCaCl2重懸每份沉淀，放于冰上 ， 4℃4000轉(zhuǎn) /分離心10min，回收細(xì)菌細(xì)胞；
6 每50ml初始培養(yǎng)物用2ml冰預(yù)冷的0.1M CaCl2重懸每份沉定，此時(shí)，可以迅速將細(xì)胞分裝成小份，液氮中冰凍，-70℃貯存?zhèn)溆谩?br />7 用無(wú)菌吸頭從感受態(tài)細(xì)胞懸液中取200μl轉(zhuǎn)移到無(wú)菌的微量離心管中，加DNA或連接反應(yīng)混合物（體積≤10μl，DNA≤50ng），輕旋以混勻內(nèi)容物，冰浴30min；
8 將離心管放到預(yù)加溫到42℃的水浴中，90s；
9 將混合物快速轉(zhuǎn)移到冰浴中，冷卻1-2分鐘，加入適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基在37 ℃培養(yǎng)45 分鐘，使細(xì)胞復(fù)蘇，并表達(dá)質(zhì)粒所攜帶的轉(zhuǎn)化基因；
10 將適當(dāng)體積（每個(gè)90mm平板可達(dá)200μl）已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到相應(yīng)抗生素的平板培養(yǎng)基上。
11 將平板置于室溫至液體被吸收 ，倒置平板于37℃培養(yǎng)箱中，12～16h，平板培養(yǎng)，克隆在此期間應(yīng)該出現(xiàn)，否則轉(zhuǎn)化不成功。
于37℃振搖培養(yǎng)約2～3h（旋轉(zhuǎn)搖床200～300r/min），每隔20～30min測(cè)量OD600值≈0.4。
2．在無(wú)菌條件下將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個(gè)，用冰預(yù)冷的50ml聚丙烯離心管中，冰上放置10～20min；
3 于4℃4000轉(zhuǎn) /分離心10min，回收細(xì)菌細(xì)胞；
4 將管倒置1min，以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡；
5 以10ml用冰預(yù)冷的0.1mMCaCl2重懸每份沉淀，放于冰上 ， 4℃4000轉(zhuǎn) /分離心10min，回收細(xì)菌細(xì)胞；
6 每50ml初始培養(yǎng)物用2ml冰預(yù)冷的0.1M CaCl2重懸每份沉定，此時(shí)，可以迅速將細(xì)胞分裝成小份，液氮中冰凍，-70℃貯存?zhèn)溆谩?br />7 用無(wú)菌吸頭從感受態(tài)細(xì)胞懸液中取200μl轉(zhuǎn)移到無(wú)菌的微量離心管中，加DNA或連接反應(yīng)混合物（體積≤10μl，DNA≤50ng），輕旋以混勻內(nèi)容物，冰浴30min；
8 將離心管放到預(yù)加溫到42℃的水浴中，90s；
9 將混合物快速轉(zhuǎn)移到冰浴中，冷卻1-2分鐘，加入適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基在37 ℃培養(yǎng)45 分鐘，使細(xì)胞復(fù)蘇，并表達(dá)質(zhì)粒所攜帶的轉(zhuǎn)化基因；
10 將適當(dāng)體積（每個(gè)90mm平板可達(dá)200μl）已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到相應(yīng)抗生素的平板培養(yǎng)基上。
11 將平板置于室溫至液體被吸收 ，倒置平板于37℃培養(yǎng)箱中，12～16h，平板培養(yǎng)，克隆在此期間應(yīng)該出現(xiàn)，否則轉(zhuǎn)化不成功。
