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流式細(xì)胞計(jì)的基本結(jié)構(gòu)流式細(xì)胞計(jì)主要由四部分組成。它們是：流動(dòng)室和液流系統(tǒng)；激光源和光學(xué)系統(tǒng)；光電管和檢測(cè)系統(tǒng)；計(jì)算機(jī)和分析系統(tǒng)。
（1）流動(dòng)室和液流系統(tǒng)：流動(dòng)室由樣品管、鞘液管和噴嘴等組成，常用光學(xué)玻璃、石英等透明、穩(wěn)定的材料制作。設(shè)計(jì)和制作均很精細(xì)，是液流系統(tǒng)的心臟。樣品管貯放樣品，單個(gè)細(xì)胞懸液在液流壓力作用下從樣品管射出；鞘液由鞘液管從四周流向噴孔，包圍在樣品外周后從噴嘴射出。為了保證液流是穩(wěn)液，一般限制液流速度υ<10m/s。由于鞘液的作用，被檢測(cè)細(xì)胞被限制在液流的軸線上。流動(dòng)室上裝有壓電晶體，受到振蕩信號(hào)可發(fā)生振動(dòng)。
（2）激光源和光學(xué)系統(tǒng)：經(jīng)特異熒光染色的細(xì)胞需要合適的光源照射激發(fā)才能發(fā)出熒光供收集檢測(cè)。常用的光源有弧光燈和激光；激光器又以氬離子激光器為普遍，也有配和氪離子激光器或染料激光器。光源的選擇主要根據(jù)被激發(fā)物質(zhì)的激發(fā)光譜而定。汞燈是最常用的弧光燈，其發(fā)射光譜大部分集中于300～400nm，很適合需要用紫外光激發(fā)的場(chǎng)合。氬離子激光器的發(fā)射光譜中，綠光514nm和藍(lán)光488nm的譜線最強(qiáng)，約占總光強(qiáng)的80%；氪離子激光器光譜多集中在可見(jiàn)光部分，以647nm較強(qiáng)。免疫學(xué)上使用的一些熒光染料激發(fā)光波長(zhǎng)在550nm以上，可使用染料激光器。將有機(jī)染料做為激光器泵浦的一種成份，可使原激光器的光譜發(fā)生改變以適應(yīng)需要即構(gòu)成染料激光器。例如用氬離子激光器的綠光泵浦含有Rhodamine 6G水溶液的染料激光器,則可得到550～650nm連續(xù)可調(diào)的激光，尤在590nm處轉(zhuǎn)換效率最高，約可占到一半。為使細(xì)胞得到均勻照射，并提高分辨率，照射到細(xì)胞上的激光光斑直徑應(yīng)和細(xì)胞直徑相近。因此需將激光光束經(jīng)透鏡會(huì)聚。光斑直徑d可由下式確定：d=4λf/πD。λ為激光波長(zhǎng)；f為透鏡焦距；D為激光束直徑。色散棱鏡用來(lái)選擇激光的波長(zhǎng)，調(diào)整反射鏡的角度使調(diào)諧到所需要的波長(zhǎng)λ。為了進(jìn)一步使檢測(cè)的發(fā)射熒光更強(qiáng)，并提高熒光訊號(hào)的信噪比，在光路中還使用了多種濾片。帶阻或帶通濾片是有選擇性地使某一濾長(zhǎng)區(qū)段的光線濾除或通過(guò)。例如使用525nm帶通濾片只允許FITC（Fluoresceinisothiocyanate,異硫氰熒光素）發(fā)射的525nm綠光通過(guò)。長(zhǎng)波通過(guò)二向色性反射鏡只允許某一波長(zhǎng)以上的光線通過(guò)而將此波長(zhǎng)以下的另一特定波長(zhǎng)的光線反射。在免疫分析中常要同時(shí)探測(cè)兩種以上的波長(zhǎng)的熒光信號(hào)，就采用二向色性反射鏡，或二向色性分光器，來(lái)有效地將各種熒光分開。
�。�3）光電管和檢測(cè)系統(tǒng)：經(jīng)熒光染色的細(xì)胞受合適的光激發(fā)后所產(chǎn)生的熒光是通過(guò)光電轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)變成電信號(hào)而進(jìn)行測(cè)量的。光電倍增管（PMT）最為常用。PMT的響應(yīng)時(shí)間短，僅為ns數(shù)量級(jí)；光譜響應(yīng)特性好，在200～900nm的光譜區(qū)，光量子產(chǎn)額都比較高。光電倍增管的增益從103到108可連續(xù)調(diào)節(jié) ，因此對(duì)弱光測(cè)量十分有利。光電管運(yùn)行時(shí)特別要注意穩(wěn)定性問(wèn)題，工作電壓要十分穩(wěn)定，工作電流及功率不能太大。一般功耗低于0.5W；最大陽(yáng)極電流在幾個(gè)毫安。此外要注意對(duì)光電管進(jìn)行暗適應(yīng)處理，并注意良好的磁屏蔽。在使用中還要注意安裝位置不同的PMT，因?yàn)楣庾V響應(yīng)特性不同，不宜互換。也有用硅光電二極管的，它在強(qiáng)光下穩(wěn)定性比PMT好。
從PMT輸出的電信號(hào)仍然較弱，需要經(jīng)過(guò)放大后才能輸入分析儀器。流式細(xì)胞計(jì)中一般備有兩類放大器。一類是輸出信號(hào)輻度與輸入信號(hào)成線性關(guān)系，稱為線性放大器。線性放大器適用于在較小范圍內(nèi)變化的信號(hào)以及代表生物學(xué)線性過(guò)程的信號(hào)，例DNA測(cè)量等。另一類是對(duì)數(shù)放大器，輸出信號(hào)和輸入信號(hào)之間成常用對(duì)數(shù)關(guān)系。在免疫學(xué)測(cè)量中常使用對(duì)數(shù)放大器。因?yàn)樵诿庖叻治鰰r(shí)常要同時(shí)顯示陰性、陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性三個(gè)亞群，它們的熒光強(qiáng)度相差1～2個(gè)數(shù)量級(jí)；而且在多色免疫熒光測(cè)量中，用對(duì)數(shù)放大器采集數(shù)據(jù)易于解釋。此外還有調(diào)節(jié) 便利、細(xì)胞群體分布形狀不易受外界工作條件影響等優(yōu)點(diǎn)。
�。�4）計(jì)算機(jī)和分析系統(tǒng)：經(jīng)放大后的電信號(hào)被送往計(jì)算機(jī)分析器。多道的道數(shù)是和電信號(hào)的脈沖高度相對(duì)應(yīng)的，也是和光信號(hào)的強(qiáng)弱相關(guān)的。對(duì)應(yīng)道數(shù)年縱坐標(biāo)通常代表發(fā)出該信號(hào)的細(xì)胞相對(duì)數(shù)目。多道分析器出來(lái)的信號(hào)再經(jīng)模-數(shù)轉(zhuǎn)換器輸往微機(jī)處理器編成數(shù)據(jù)文件，或存貯于計(jì)算機(jī)的硬盤和軟盤上，或存于儀器內(nèi)以備調(diào)用。計(jì)算機(jī)的存貯容量較大，可存貯同一細(xì)胞的6～8個(gè)參數(shù)。存貯于計(jì)算機(jī)內(nèi)的數(shù)據(jù)可以在實(shí)測(cè)后脫機(jī)重現(xiàn)，進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，最后給出結(jié)果。除上述四個(gè)主要部分外，還備有電源及壓縮氣體等附加裝置。
（1）流動(dòng)室和液流系統(tǒng)：流動(dòng)室由樣品管、鞘液管和噴嘴等組成，常用光學(xué)玻璃、石英等透明、穩(wěn)定的材料制作。設(shè)計(jì)和制作均很精細(xì)，是液流系統(tǒng)的心臟。樣品管貯放樣品，單個(gè)細(xì)胞懸液在液流壓力作用下從樣品管射出；鞘液由鞘液管從四周流向噴孔，包圍在樣品外周后從噴嘴射出。為了保證液流是穩(wěn)液，一般限制液流速度υ<10m/s。由于鞘液的作用，被檢測(cè)細(xì)胞被限制在液流的軸線上。流動(dòng)室上裝有壓電晶體，受到振蕩信號(hào)可發(fā)生振動(dòng)。
（2）激光源和光學(xué)系統(tǒng)：經(jīng)特異熒光染色的細(xì)胞需要合適的光源照射激發(fā)才能發(fā)出熒光供收集檢測(cè)。常用的光源有弧光燈和激光；激光器又以氬離子激光器為普遍，也有配和氪離子激光器或染料激光器。光源的選擇主要根據(jù)被激發(fā)物質(zhì)的激發(fā)光譜而定。汞燈是最常用的弧光燈，其發(fā)射光譜大部分集中于300～400nm，很適合需要用紫外光激發(fā)的場(chǎng)合。氬離子激光器的發(fā)射光譜中，綠光514nm和藍(lán)光488nm的譜線最強(qiáng)，約占總光強(qiáng)的80%；氪離子激光器光譜多集中在可見(jiàn)光部分，以647nm較強(qiáng)。免疫學(xué)上使用的一些熒光染料激發(fā)光波長(zhǎng)在550nm以上，可使用染料激光器。將有機(jī)染料做為激光器泵浦的一種成份，可使原激光器的光譜發(fā)生改變以適應(yīng)需要即構(gòu)成染料激光器。例如用氬離子激光器的綠光泵浦含有Rhodamine 6G水溶液的染料激光器,則可得到550～650nm連續(xù)可調(diào)的激光，尤在590nm處轉(zhuǎn)換效率最高，約可占到一半。為使細(xì)胞得到均勻照射，并提高分辨率，照射到細(xì)胞上的激光光斑直徑應(yīng)和細(xì)胞直徑相近。因此需將激光光束經(jīng)透鏡會(huì)聚。光斑直徑d可由下式確定：d=4λf/πD。λ為激光波長(zhǎng)；f為透鏡焦距；D為激光束直徑。色散棱鏡用來(lái)選擇激光的波長(zhǎng)，調(diào)整反射鏡的角度使調(diào)諧到所需要的波長(zhǎng)λ。為了進(jìn)一步使檢測(cè)的發(fā)射熒光更強(qiáng)，并提高熒光訊號(hào)的信噪比，在光路中還使用了多種濾片。帶阻或帶通濾片是有選擇性地使某一濾長(zhǎng)區(qū)段的光線濾除或通過(guò)。例如使用525nm帶通濾片只允許FITC（Fluoresceinisothiocyanate,異硫氰熒光素）發(fā)射的525nm綠光通過(guò)。長(zhǎng)波通過(guò)二向色性反射鏡只允許某一波長(zhǎng)以上的光線通過(guò)而將此波長(zhǎng)以下的另一特定波長(zhǎng)的光線反射。在免疫分析中常要同時(shí)探測(cè)兩種以上的波長(zhǎng)的熒光信號(hào)，就采用二向色性反射鏡，或二向色性分光器，來(lái)有效地將各種熒光分開。
�。�3）光電管和檢測(cè)系統(tǒng)：經(jīng)熒光染色的細(xì)胞受合適的光激發(fā)后所產(chǎn)生的熒光是通過(guò)光電轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)變成電信號(hào)而進(jìn)行測(cè)量的。光電倍增管（PMT）最為常用。PMT的響應(yīng)時(shí)間短，僅為ns數(shù)量級(jí)；光譜響應(yīng)特性好，在200～900nm的光譜區(qū)，光量子產(chǎn)額都比較高。光電倍增管的增益從103到108可連續(xù)調(diào)節(jié) ，因此對(duì)弱光測(cè)量十分有利。光電管運(yùn)行時(shí)特別要注意穩(wěn)定性問(wèn)題，工作電壓要十分穩(wěn)定，工作電流及功率不能太大。一般功耗低于0.5W；最大陽(yáng)極電流在幾個(gè)毫安。此外要注意對(duì)光電管進(jìn)行暗適應(yīng)處理，并注意良好的磁屏蔽。在使用中還要注意安裝位置不同的PMT，因?yàn)楣庾V響應(yīng)特性不同，不宜互換。也有用硅光電二極管的，它在強(qiáng)光下穩(wěn)定性比PMT好。
從PMT輸出的電信號(hào)仍然較弱，需要經(jīng)過(guò)放大后才能輸入分析儀器。流式細(xì)胞計(jì)中一般備有兩類放大器。一類是輸出信號(hào)輻度與輸入信號(hào)成線性關(guān)系，稱為線性放大器。線性放大器適用于在較小范圍內(nèi)變化的信號(hào)以及代表生物學(xué)線性過(guò)程的信號(hào)，例DNA測(cè)量等。另一類是對(duì)數(shù)放大器，輸出信號(hào)和輸入信號(hào)之間成常用對(duì)數(shù)關(guān)系。在免疫學(xué)測(cè)量中常使用對(duì)數(shù)放大器。因?yàn)樵诿庖叻治鰰r(shí)常要同時(shí)顯示陰性、陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性三個(gè)亞群，它們的熒光強(qiáng)度相差1～2個(gè)數(shù)量級(jí)；而且在多色免疫熒光測(cè)量中，用對(duì)數(shù)放大器采集數(shù)據(jù)易于解釋。此外還有調(diào)節(jié) 便利、細(xì)胞群體分布形狀不易受外界工作條件影響等優(yōu)點(diǎn)。
�。�4）計(jì)算機(jī)和分析系統(tǒng)：經(jīng)放大后的電信號(hào)被送往計(jì)算機(jī)分析器。多道的道數(shù)是和電信號(hào)的脈沖高度相對(duì)應(yīng)的，也是和光信號(hào)的強(qiáng)弱相關(guān)的。對(duì)應(yīng)道數(shù)年縱坐標(biāo)通常代表發(fā)出該信號(hào)的細(xì)胞相對(duì)數(shù)目。多道分析器出來(lái)的信號(hào)再經(jīng)模-數(shù)轉(zhuǎn)換器輸往微機(jī)處理器編成數(shù)據(jù)文件，或存貯于計(jì)算機(jī)的硬盤和軟盤上，或存于儀器內(nèi)以備調(diào)用。計(jì)算機(jī)的存貯容量較大，可存貯同一細(xì)胞的6～8個(gè)參數(shù)。存貯于計(jì)算機(jī)內(nèi)的數(shù)據(jù)可以在實(shí)測(cè)后脫機(jī)重現(xiàn)，進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，最后給出結(jié)果。除上述四個(gè)主要部分外，還備有電源及壓縮氣體等附加裝置。
