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交互扣除RNA差別顯示技術(shù)(RSDD)

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-01
交互扣除RNA差別顯示技術(shù)(RSDD)是由Kang等于1998年最新提出的結(jié)合扣除雜交和RNA差別顯示兩項(xiàng)技術(shù)發(fā)展而出的一種有效、快速分離差別表達(dá)基因序列的方法。該方法應(yīng)用于腫瘤進(jìn)展的研究,可鑒定和克隆已知的和高比率(>65%)的未知序列,這包括分別作為增強(qiáng)和抑制表達(dá)進(jìn)展功能的cDNAs,分別稱為增強(qiáng)進(jìn)展基因(PEGen)和抑制進(jìn)展基因(PSGen)。1999年通過(guò)交互扣除RNA差別顯示技術(shù)已鑒定出了16條差別表達(dá)的基因,其中有5條為未知的PEGen,6條為未知的PSGen。該方法主要由三部分組成:
交互扣除(reciprocal subtraction):首先是要獲得兩個(gè)具有差別基因表達(dá)的細(xì)胞系的cDNA文庫(kù),然后將這兩個(gè)文庫(kù)進(jìn)行交互扣除雜交,從而獲得兩個(gè)扣除cDNA文庫(kù)。隨后通過(guò)體內(nèi)剪切得到質(zhì)粒cDNA文庫(kù);
差異顯示(differentialdisplay):由交互扣除cDNA文庫(kù)獲得的純化質(zhì)?芍苯舆M(jìn)行差異顯示,這包括PCR擴(kuò)增(加入3種3′錨定引物和18種5′隨機(jī)引物)和進(jìn)行5%序列膠電泳并切割回收差異顯示條帶;
表達(dá)分析(expression analysis):運(yùn)用反向Northern印跡分析(reverse Northern blotting)和Northern Blot分析鑒定經(jīng)再擴(kuò)增的DNA片段的差異表達(dá)。反向Northern Blotting是將經(jīng)差異顯示得到的擴(kuò)增后的DNA片段轉(zhuǎn)膜,并分別與來(lái)自兩個(gè)不同細(xì)胞系總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄制備的32P標(biāo)記的cDNA第一鏈探針(reverse transcribed 32P-cDNA prob)進(jìn)行雜交。234條再次擴(kuò)增的DNA片段中有181條被探測(cè)到(77%),其差異表達(dá)顯示水平比兩種細(xì)胞間Northern blot分析要高1.8倍。最后經(jīng)Northern blotting分析得到兩種細(xì)胞系差別表達(dá)的DNA片段被克隆到載體上進(jìn)行測(cè)序分析。RSDD目前被證實(shí)對(duì)于有效且快速鑒定發(fā)生在復(fù)雜基因組以及細(xì)胞生理變化中差異表達(dá)的基因是很有價(jià)值的。
 
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