一般情況下，只要有克隆的探針，就不用寡核苷酸探針。在DNA序列未知而必須首先進(jìn)行克隆以便繪制酶譜和測(cè)序時(shí)，也常應(yīng)用克隆。克隆探針一般較寡核苷酸探針特異性強(qiáng)，復(fù)雜度也高，從統(tǒng)計(jì)學(xué)角度而言，較長(zhǎng)的序列隨機(jī)碰撞互補(bǔ)序列的機(jī)會(huì)較短序列少，克隆探針的另一優(yōu)點(diǎn)是，可獲得較強(qiáng)的雜交信號(hào)，因?yàn)榭寺√结樰^寡核苷酸探針摻入的可檢測(cè)標(biāo)記基因更多。但是，較長(zhǎng)的探針對(duì)于靶序列變異的識(shí)別能力又有所降低。對(duì)于僅是單個(gè)堿基或少數(shù)堿基不同的兩序列，克隆探針不能區(qū)分，往往雜交信號(hào)相當(dāng)。這既是其優(yōu)點(diǎn)，又是其缺點(diǎn)。優(yōu)點(diǎn)是當(dāng)用于檢測(cè)病原微生物時(shí)，不會(huì)因病毒或細(xì)菌DNA的少許變異而漏診，缺點(diǎn)則是不能用于點(diǎn)突變的檢測(cè)。這種情況下，通常要采用化學(xué)合成的寡核苷酸探針。
合成的寡核苷酸探針具有一些獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)：①由于鏈短，其序列復(fù)雜度低，分子量小，所以和等量靶位點(diǎn)完全雜交的時(shí)間比克隆探針短，如20nt的寡核苷酸探針在濃度為100ng/ml，靶序列為1～100pg、1kb片段或3×10-18~3×10-16mol/L時(shí)，達(dá)到最大程度的雜交只需10min，而用2kb的克隆探針在同樣條件下達(dá)到完全雜交則需16h。②寡核苷酸探針可識(shí)別靶序列內(nèi)1個(gè)堿基的變化，因?yàn)槎烫结樦袎A基的錯(cuò)配能大幅度地降低雜交體的Tm值。③一次可大量合成寡核苷酸探針（1～10mg），使得這種探針價(jià)格低廉，與克隆探針一樣，寡核苷酸探針能夠用酶學(xué)或化學(xué)方法修飾以進(jìn)行非放射性標(biāo)記物的標(biāo)記。盡管克隆探針較特異，但通過(guò)細(xì)心篩選序列和/或選擇相對(duì)長(zhǎng)的序列（＞30nt）亦可設(shè)計(jì)出非常特異的寡核苷酸探針。最常用的寡核苷酸探針有18～40個(gè)堿基，目前的合成儀可有效地合成至少50個(gè)堿基的探針。下面是篩選寡核苷酸針的一些原則。
�、匍L(zhǎng)18～50nt，較長(zhǎng)探針雜交時(shí)間較長(zhǎng)，合成量低；較短探針特異性會(huì)差些。
�、趬A基成分：G C含量為40%～60%，超出此范圍則會(huì)增加非特異雜交。
�、厶结�?lè)肿觾?nèi)不應(yīng)存在互補(bǔ)區(qū)，否則會(huì)出現(xiàn)抑制探針雜交的“發(fā)夾”狀結(jié)構(gòu)。
�、鼙苊鈫我粔A基的重復(fù)出現(xiàn)（不能多于4個(gè)），如-CCCCC-。
⑤一旦選定某一序更符合上述標(biāo)準(zhǔn)，最好將序列與核酸庫(kù)中核酸序列比較，探針序列應(yīng)與含靶序列的核酸雜交，而與非靶區(qū)域的同源性不能超過(guò)70%或有連續(xù)8個(gè)或更多的堿基的同源，否則，該探針不能用。
按上述原則選出的探針會(huì)增加成功的機(jī)會(huì)，選定后進(jìn)行合成與標(biāo)記，并摸索合適的雜交條件。方法是制備幾張點(diǎn)有特異靶DNA和不相關(guān)DNA的膜，各膜分別在不同溫度下與探針雜交，特異靶DNA雜交信號(hào)強(qiáng)而非特異DNA不產(chǎn)生任何雜交反應(yīng)的就是最適雜交溫度。在進(jìn)行點(diǎn)突變檢測(cè)雜交的反應(yīng)時(shí)，洗膜條件和溫度物選擇往往更為重要。所選漂洗條件必需使野生型靶DNA與探針產(chǎn)生強(qiáng)的雜交信號(hào)而突變型靶DNA則不產(chǎn)生雜交信號(hào)，這可以通過(guò)逐漸提高洗膜溫度來(lái)完成。
寡核苷酸探針還有一個(gè)重要用途。在用于檢測(cè)單個(gè)堿基差異時(shí)尚可采用一種稱為寡核苷酸限制（oligonucleotide restriction）的技術(shù)。該技術(shù)只有在突變點(diǎn)位于某一限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)時(shí)才有效。例如，鐮刀狀紅細(xì)胞貧血是因β珠蛋白基因的第6個(gè)寡碼子由GAG變成GTG，從而導(dǎo)致所編碼氨基酸由酪氨酸變成纈氨酸。突變的β-珠蛋白功能異常，稱作S珠蛋白，而野生型稱為A珠蛋白，其基因型分別為βS和βA。恰好突變點(diǎn)A→T位于Del I的識(shí)別序列CT－NAG之內(nèi)，這就為設(shè)計(jì)寡核苷酸限制實(shí)驗(yàn)創(chuàng)造了條件。方法是合成一個(gè)長(zhǎng)40個(gè)堿基的寡核苷酸探針，其5’末端距突變堿基有11個(gè)堿基，該探針與βA基因的非編碼鏈互補(bǔ)。將此探針的5’末端標(biāo)記上32P。雜交方法采用液相雜交法，即在液相中將靶DNA變性解矗?緩笥胩秸臚嘶穡???詠惶�。冉愋DNA為βA型，則兩條鏈完全互補(bǔ)，并產(chǎn)生Dde I的酶切位點(diǎn)；如待檢DNA為βS型，則所形成的雜交體中兩條鏈在突變堿基處不配對(duì)，從而不能被Del I所識(shí)別。用Del I消化雜交DNA，顯然βA會(huì)被切開(kāi)而βS不被切開(kāi)。βADNA雜交體被切開(kāi)后，5’端探針序列因只有8個(gè)堿基，與雜交鏈結(jié)合不緊而解離，從而產(chǎn)生游離的5’端標(biāo)記8核苷酸單鏈。不被切開(kāi)的βS雜交體尚可被另一個(gè)限制酶Hinf I消化，該酶的識(shí)別位點(diǎn)緊靠Del I 識(shí)別位點(diǎn)上游。βS雜交DNA經(jīng)Hinf I消化后，將釋出探針DNA的5’末端3核苷酸小片段。βADNA雜交體因已無(wú)Hinf I識(shí)別序列，故而不能被Hinf I消化。這樣βA和βSDNA經(jīng)此寡核苷酸探針雜交和Del I及Hinf I消化后，分別產(chǎn)生游離的8核苷酸（8nt）和3核苷酸（3nt） 片段，它們可以經(jīng)電泳分離后進(jìn)行放射自顯影而獲證實(shí)。藉此策略，可輕易將各種β珠蛋白突變型鑒別開(kāi)，如純合野生型AA結(jié)果為僅有8nt片段，純合突變型SS則僅可檢出3nt片段，而雜合子AS型則兩種片段均存在。
