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聚丙烯酰胺凝膠電泳 可用于蛋白和寡核苷酸的分離，最常用于蛋白質(zhì)的分離，這里總結(jié)了DNA電泳的各種濃度PAGE膠配制的配方及制備方法。
聚丙烯酰胺 凝膠電泳簡(jiǎn)稱為PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis），是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)。聚丙烯酰胺凝膠是由單體的丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺聚合而成，這一聚合過(guò)程需要有自由基催化完成。
各種濃度PAGE膠的配制(DNA電泳用)
50ml體系：
|
丙烯酰胺 |
有效分離（bp) |
二甲苯青 |
溴酚藍(lán) |
丙烯酰胺30%（ml） |
10×TBE（ml) |
ddH2O（ml） |
TEMED（µl） |
過(guò)硫酸銨10%（µl） |
|
3.5% |
100-1000 |
460 |
100 |
5.83 |
5 |
39.17 |
25.0 |
250 |
|
5.0% |
100-500 |
260 |
65 |
8.33 |
5 |
36.67 |
25.0 |
250 |
|
8.0% |
60-400 |
160 |
45 |
13.33 |
5 |
31.67 |
25.0 |
250 |
|
12.0% |
40-200 |
70 |
20 |
20.0 |
5 |
25.00 |
25.0 |
250 |
|
15.0% |
25-150 |
60 |
15 |
25.0 |
5 |
20.00 |
25.0 |
250 |
|
20.0% |
5-100 |
45 |
12 |
33.33 |
5 |
11.67 |
25.0 |
250 |
5ml體系：
|
丙烯酰胺 |
丙烯酰胺30% |
10×TBE |
ddH2O |
TEMED |
過(guò)硫酸銨10% |
|
3.5% |
0.583 |
0.5 |
3.917 |
2.5 |
25 |
|
5.0% |
0.833 |
0.5 |
3.667 |
2.5 |
25 |
|
8.0% |
1.333 |
0.5 |
3.167 |
2.5 |
25 |
|
12.0% |
2.00 |
0.5 |
2.5 |
2.5 |
25 |
|
15.0% |
2.50 |
0.5 |
2.0 |
2.5 |
25 |
|
20.0% |
3.333 |
0.5 |
1.167 |
2.5 |
25 |
1、丙烯酰胺30%為29：1(質(zhì)量比，丙烯酰胺：雙甲叉丙烯酰胺)
2、TEMED 可以加到1ul/ml。
不同濃度丙烯酰胺和DNA的有效分離范圍表
|
丙烯酰胺(%) |
有效分離范圍(bp) |
溴酚蘭* |
二甲苯青* |
|
3.5 |
100～2000 |
100 |
460 |
|
5.0 |
80～500 |
65 |
260 |
|
8.0 |
60～400 |
45 |
160 |
|
12.0 |
40～200 |
30 |
70 |
|
15.0 |
25～150 |
15 |
60 |
|
20.0 |
10～100 |
12 |
45 |
*表中給出的數(shù)字為與指示劑遷移率相等的雙鏈DNA分子 所含堿基對(duì)數(shù)目(bp).
凝膠的制備過(guò)程：
1、 按要求裝配好垂直電泳板，兩塊玻璃板的兩側(cè)及底部用1%的瓊脂糖封邊，防止封閉不嚴(yán)而使聚丙烯酰胺液漏出。
2、 將裝好的玻璃電泳板傾斜成45～60°。
3、 按表3配制所需%濃度凝膠的毫升數(shù)。
4、 加入TEMED后，立即混勻，緩緩倒入兩玻璃板間的膠床中，直到液體接近溢出時(shí)為止。
5、 立即插入適當(dāng)?shù)氖嶙�，密切注意防止梳齒下產(chǎn)生氣泡，用一有力的夾將梳子夾在一邊的玻璃板上，然后將玻璃板斜靠在物體上，使成10°角，可減少液體泄漏的機(jī)會(huì)。
6、 室溫聚合一小時(shí)后，將玻璃板插入電泳槽中，上緊，倒入0.1XTBE緩沖液。
7、 小心取出梳子，加樣。
大家可以根據(jù)自己試驗(yàn)中DNA片段大小的不同選擇配制合適濃度的丙烯酰胺膠。PAGE膠配制過(guò)程中記得避免氣泡的產(chǎn)生。
