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1.乳及乳制品中真蛋白的概述
通過(guò)測(cè)定總氮含量而計(jì)算得到的蛋白質(zhì)含量稱為粗蛋白(crude protein,CP) ,目前國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法中測(cè)定的即為粗蛋白含量。乳中的氮含量包括蛋白態(tài)氮(proteinnitrogen,PN)和非蛋白態(tài)氮(non protein nitrogen,NPN),其中前者占95% ,后者約占5%。蛋白質(zhì)是乳中的主要含氮物質(zhì),含量約2.8%～3.8%。乳蛋白包括酪蛋白、乳清蛋白及少量脂肪球膜蛋白。乳清蛋白中有對(duì)熱不穩(wěn)定的乳白蛋白和乳球蛋白,上述蛋白構(gòu)成了乳中的“真蛋白”。
蛋白質(zhì)是牛奶的主要成分，且牛奶中的蛋白質(zhì)是完全的蛋白質(zhì)，由于含有人體必需的氨基酸，所以營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高，牛奶中的蛋白質(zhì)消化率可以達(dá)到90%～100%。乳中其他含氮物主要來(lái)源于乳中的氨、尿素、肌酸、肌酸酐、尿酸、乳清酸、多肽、馬尿酸、氨基酸和其他成分,這些成分構(gòu)成了非蛋白質(zhì)氮。
真蛋白(true protein,TP)即真正的蛋白質(zhì),在測(cè)定方面可定義為除了非蛋白質(zhì)氮以外的蛋白態(tài)氮所計(jì)算得到的蛋白,正常情況下,天然乳中真蛋白的含量少于粗蛋白。酪蛋白是乳品真蛋白中最重要的蛋白質(zhì),主要以膠束狀態(tài)存在于乳中,它是以含磷蛋白質(zhì)為主體的幾種蛋白質(zhì)的復(fù)合體,主要分為αs12酪蛋白、αs22酪蛋白、β2酪蛋白和κ2酪蛋白4種。一般情況下,乳品真蛋白中約有80%為酪蛋白,但其含量因個(gè)體差異、牧場(chǎng)管理、乳牛品種的不同而變化。
2.乳及乳制品中真蛋白測(cè)定的研究背景
牛奶及乳制品中含有豐富的蛋白質(zhì)，但在牛奶收購(gòu)、生產(chǎn)環(huán)節(jié)中，質(zhì)量摻假事件時(shí)有發(fā)生，尤以“劣質(zhì)假奶粉”事件和“三聚氰胺奶粉”事件為甚。目前，乳制品的消費(fèi)量很大，根據(jù)FAO統(tǒng)計(jì)，世界人均年消費(fèi)乳制品46kg，是日常飲食結(jié)構(gòu)的重要組成部分，它的安全性直接影響到人們的身體健康，所以一旦出現(xiàn)質(zhì)量或安全問(wèn)題，它暴露的受害人群和風(fēng)險(xiǎn)就會(huì)高一些。尤其牛奶對(duì)嬰幼兒有代母乳的作用，在嬰兒成長(zhǎng)的特定階段，成為其全部營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，因而，乳制品的安全至關(guān)重要，世界各國(guó)都對(duì)乳制品的質(zhì)量控制制定了相當(dāng)嚴(yán)密的標(biāo)準(zhǔn)體系。
目前檢測(cè)蛋白質(zhì)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法是凱氏定氮法，其結(jié)果只是氮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，而不是真正意義上的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。這種缺陷造成某些不法分子對(duì)牛奶進(jìn)行摻假，添加硫酸銨、三聚氰胺、水解植物或動(dòng)物蛋白等含氮物質(zhì)。要杜絕這類問(wèn)題，必須建立真蛋白質(zhì)的檢測(cè)方法。
3.乳品中真蛋白的測(cè)定方法：
3.1 電位滴定法
2009年唐偉英等人為排除牛乳中三聚氰胺等非蛋白氮的干擾，探索研究了電位滴定法測(cè)定牛乳中真蛋白的含量。它的基本原理為：蛋白質(zhì)的兩端有游離的具有酸性的羧基（－COOH）和堿性的氨基（－NH2），當(dāng)加入甲醛溶液時(shí)，氨基上的兩個(gè)氫原子被次甲基所取代，于是便失去了氨基的堿性特性，從而使其呈酸性的羧基釋放出來(lái)，使溶液的電化學(xué)特性發(fā)生變化。再用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定游離的羧基（－COOH），從而用經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算其蛋白質(zhì)含量。
與凱式定氮法相比，該法可以排除三聚氰胺、尿素對(duì)牛乳中蛋白質(zhì)測(cè)定的干擾，其次該方法所需檢測(cè)儀器及試劑常規(guī)，操作簡(jiǎn)便，而且大大縮短了測(cè)定時(shí)間，提高了工作效率，具有一定的推廣使用價(jià)值。但從其原理中不難得出此法不能排除銨態(tài)氮（氯化銨、硫酸銨、碳酸銨等）的干擾，有一定的局限性。針對(duì)這一漏洞唐英偉等人在2009年提出了改進(jìn)方法即：在測(cè)定前在試樣中加入濃堿液加熱檢查有無(wú)氨氣放出，驗(yàn)證有無(wú)銨態(tài)氮。若有，則先將銨態(tài)氮分離出去，再用電位滴定法測(cè)定；若沒(méi)有，則可直接用電位滴定法測(cè)定。
3.2 三氯乙酸-雙縮脲比色法
該方法的基本原理為：采用150g/L 的三氯乙酸溶液(在混合物中的最終濃度約為120g/L)沉淀乳中的蛋白質(zhì),用過(guò)濾法分離沉淀和溶液,沉淀部分含蛋白態(tài)氮,非沉淀部分(溶液)含非蛋白態(tài)氮。將濾渣收集起來(lái),再用雙縮脲法進(jìn)行定氮。即可得出樣品中的真蛋白含量。2011年侯彩云等人利用該方法提出了真蛋白率這一概念。并測(cè)定了添加過(guò)乳清蛋白乳粉的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果表明，乳清蛋白的加標(biāo)回收率在89.2%~99%之間，重現(xiàn)性在0.26%~0.98%之間，表明三氯乙酸-雙縮脲比色法可以較好地檢測(cè)出乳中的真蛋白。
該方法是對(duì)凱式定氮法的改進(jìn)，在樣品檢測(cè)前先將其中的蛋白質(zhì)沉淀，可以很好的排除三聚氰胺、尿素等非蛋白氮的干擾。后期采用雙縮脲法對(duì)濾渣進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測(cè)定，且操作簡(jiǎn)便迅速，可提高工作效率，但靈敏度比較低,測(cè)定范圍為1～20mg蛋白質(zhì),適用于精度要求不高的蛋白質(zhì)含量測(cè)定。
3.3 紫外分光光度法
紫外分光光度法的基本原理為：蛋白質(zhì)中含帶共軛雙鍵的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基,使蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì),其吸收峰在280nm 處,吸光度與蛋白質(zhì)含量成線性關(guān)系,因此,通過(guò)測(cè)蛋白質(zhì)溶液的吸光度,即可測(cè)得樣品中蛋白質(zhì)的含量。2010年陳靜等人采用紫外分光光度計(jì)，在280 nm波長(zhǎng)處，通過(guò)吸光度值來(lái)測(cè)定真蛋白質(zhì)量濃度；采用FT-120、甲醛滴定法、凱氏定氮法進(jìn)行對(duì)比驗(yàn)證；考察人為添加非蛋白類含氮物質(zhì)氯化銨、硫酸銨、尿素對(duì)真蛋白含量檢測(cè)結(jié)果的影響。測(cè)得蛋白質(zhì)量濃度的回收率在94.0%~106.7%之間，通過(guò)精密度實(shí)驗(yàn)，得到相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.06%。結(jié)果表明，紫外分光光度法檢測(cè)真蛋白質(zhì)量濃度與其他3種檢測(cè)方法差異不顯著；且檢測(cè)結(jié)果不受人為添加非蛋白類含氮物質(zhì)的影響。
紫外分光光度法檢測(cè)生鮮牛乳真蛋白質(zhì)量濃度，方法快速、可行，非蛋白態(tài)氮不能計(jì)入蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，可以有效防止不法分子以含氮有機(jī)物冒充蛋白質(zhì)的違法行徑。
3.4 考馬斯亮藍(lán)G-250法
考馬斯亮藍(lán)法是由考馬斯亮藍(lán)G-250染料與蛋白質(zhì)通過(guò)范德華引力結(jié)合,使蛋白質(zhì)染色,通過(guò)比色測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法。2007年南亞等人研究了最佳實(shí)驗(yàn)條件,成功地建立一個(gè)牛乳中蛋白質(zhì)快速測(cè)定的方法,具有簡(jiǎn)單、快捷、易行等特點(diǎn)。結(jié)果表明該方法精密度高,RSD為1.70%,結(jié)果準(zhǔn)確,相對(duì)誤差較小,回收率98.2%~100.3%。
考馬斯亮藍(lán)G-250與蛋白質(zhì)結(jié)合的反應(yīng)十分迅速且穩(wěn)定,這一方法具有靈敏度高、干擾物質(zhì)少、測(cè)定快速、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn),不受酚類、游離氨基酸和緩沖劑、絡(luò)合劑的影響,適合大量樣品的測(cè)定，可推廣到其他乳制品及保健食品、植物蛋白飲料等中的蛋白質(zhì)測(cè)定。但由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此用于不同蛋白質(zhì)測(cè)定時(shí)有較大的偏差。
3.5 凝膠柱層析——考馬斯亮藍(lán)染色法
考馬斯亮藍(lán)染色測(cè)定蛋白質(zhì)是一種經(jīng)典的方法，但按傳統(tǒng)方法配成的顯色劑卻存在著溶解不完全、比色池上極易沉積等問(wèn)題，實(shí)際操作時(shí)對(duì)測(cè)定的準(zhǔn)確性干擾較大。為此2010年張弘等人對(duì)考馬斯亮藍(lán)顯色劑中進(jìn)行了改良，加入了大分子的醇類和酚類物質(zhì)，新研制的顯色劑溶液溶解度好，比色池上沉積很少，且穩(wěn)定，存放一年不影響測(cè)定。此外還研發(fā)出了牛奶蛋白質(zhì)快速檢測(cè)儀，該儀器體積小、操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)速度快、靈敏度高，且能有效消除添加的三聚氰胺、尿素、硫酸銨等無(wú)機(jī)氮，及水解植物和動(dòng)物蛋白等小分子多肽氮對(duì)牛奶中蛋白質(zhì)檢測(cè)的干擾，從而能從根本上杜絕牛奶中摻假蛋白檢測(cè)題，可用于現(xiàn)場(chǎng)牛奶真蛋白質(zhì)快速檢測(cè)。結(jié)果表明，牛奶中蛋白質(zhì)分子量絕大部分集中分布在1×104~7×104u以上和1×104u以下分子量的蛋白質(zhì)所占的比例很小。綜合應(yīng)用牛奶中蛋白質(zhì)的分子量分布特征和考馬斯亮藍(lán)染色法的特性研發(fā)出。
該法通過(guò)對(duì)考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行改良，基于馬斯亮藍(lán)染色法的特性和牛奶中蛋白質(zhì)分子量的分布特征研制出牛奶蛋白質(zhì)快速檢測(cè)儀。分子量約1ku以上含氮物中的肽鏈和考馬斯亮藍(lán)結(jié)合，在波長(zhǎng)595nm處達(dá)到最大吸收值。牛奶中的蛋白質(zhì)主要是酪蛋白和清蛋白兩大類，它們的分子量大多在1×104 ~3×104u；蛋白質(zhì)分離檢測(cè)儀檢測(cè)的結(jié)果表明：牛奶中的蛋白質(zhì)分子量集中分布在1×104~7×104u，和考馬斯亮藍(lán)的顯色作用非常明顯，因此靈敏度很高。牛奶中的其他物質(zhì)，如脂肪、多糖、維生素等均不與考馬斯亮藍(lán)作用，摻假物質(zhì)，如三聚氰胺、尿素和硫酸銨等基本也不顯色，因此能有效識(shí)別；而水解植物和動(dòng)物蛋白中，大部分是小分子肽，只有很少一部分的大分子蛋白質(zhì)才能顯色，但如果要達(dá)到和牛奶相同的顯色值，含氮量要達(dá)到牛奶的20倍左右才能做到，因此，用牛奶蛋白質(zhì)快速檢測(cè)儀測(cè)定蛋白質(zhì)，可有效地防止牛奶中摻假蛋白質(zhì)的干擾，從而能從根本上杜絕牛奶中摻假蛋白的檢測(cè)問(wèn)題，可用于現(xiàn)場(chǎng)牛奶真蛋白質(zhì)的快速檢測(cè)。
3.6 毛細(xì)管電泳法
電泳是指在電場(chǎng)作用下,帶電粒子向著與其所帶電荷電性相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象。電泳法,就是指帶電荷的供試品(如蛋白質(zhì)、核苷酸等) 在惰性支持介質(zhì)(如濾紙、醋酸纖維素、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等) 中,在電場(chǎng)的作用下,向其對(duì)應(yīng)的電極方向按各自的速度進(jìn)行泳動(dòng),由于各組分之間的移動(dòng)速度不同,使各組分分離成狹窄的區(qū)帶,并用適宜的檢測(cè)方法記錄其電泳區(qū)帶圖譜或計(jì)算其百分含量的方法。
毛細(xì)管電泳法也稱高效毛細(xì)管電泳法,它是近十幾年發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新的分析方法,結(jié)合了電泳和色譜兩大技術(shù)。Miralles等人用CE法對(duì)乳中變性的β2乳球蛋白和對(duì)位2κ2酪蛋白進(jìn)行了分離和定量測(cè)定,并研究了pH值、尿素濃度、檸檬酸濃度、電壓等因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響,結(jié)果表明該法可在30min完成乳制品中變性β2乳球蛋白和對(duì)位2κ2酪蛋白的定量檢測(cè)。但是由于該法使用的儀器昂貴、操作較為復(fù)雜,在一定程度上限制了它的應(yīng)用范圍。
3.7 紅外光譜分析法
近紅外光譜是介于可見光(VIS)和中紅外光(MIR 或IR)之間的電磁波, 美國(guó)材料檢測(cè)協(xié)會(huì)(ASTM) 將近紅外光譜區(qū)定義為波長(zhǎng)780～2 526 nm的光譜區(qū)。通過(guò)分子振動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)的狀態(tài)變化在不同能級(jí)間產(chǎn)生躍遷,當(dāng)其能量與近紅外光譜區(qū)內(nèi)某一波長(zhǎng)處光子的能量相當(dāng)時(shí),可產(chǎn)生近紅外光譜吸收。食品中蛋白質(zhì)和多肽在這個(gè)波段的特征吸收可以用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)的含量。
近紅外光譜技術(shù)的主要特點(diǎn)有:分析速度快、分析效率高、適用的樣品范圍廣,對(duì)樣品無(wú)損傷等。已廣泛應(yīng)用于谷物、乳類、肉類、烘焙類、豆類蛋白質(zhì)的分析測(cè)定中,但儀器價(jià)格昂貴,靈敏度相對(duì)較低。
3.8 數(shù)字圖像法
該方法是基于雙縮脲反應(yīng)原理, 通過(guò)一次性采集標(biāo)樣和試樣乳粉處理液的圖像信息,得出試樣乳粉的蛋白質(zhì)含量。
王旭等人利用凱氏定氮法和數(shù)字圖像法測(cè)定添加了不同NPN的乳粉蛋白質(zhì)含量,分析非蛋白態(tài)氮對(duì)凱氏定氮法和數(shù)字圖像法測(cè)定乳粉蛋白質(zhì)含量的影響。結(jié)果表明，對(duì)于沒(méi)有人為添加非蛋白態(tài)氮的乳粉來(lái)說(shuō), 用凱氏定氮法和數(shù)字圖像法測(cè)定結(jié)果具有較好的一致性。當(dāng)乳粉中含有大量NPN時(shí), 凱氏定氮法測(cè)得的粗蛋白含量無(wú)法體現(xiàn)蛋白質(zhì)的真實(shí)情況。一旦乳粉中惡意添加大量非蛋白態(tài)氮,采用數(shù)字圖像法測(cè)定蛋白質(zhì)含量, 其結(jié)果不受干擾。數(shù)字圖像法大體上可以看作針對(duì)真蛋白質(zhì)特有的反應(yīng), 非蛋白態(tài)含氮物質(zhì)對(duì)測(cè)定結(jié)果沒(méi)有影響, 測(cè)定乳粉中的真蛋白含量具有較高的準(zhǔn)確性。
3.9 直讀法
蛋白質(zhì)分子凝聚從溶液中析出的現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)沉淀(precipitation),變性蛋白質(zhì)一般易于沉淀,但也可不變性而使蛋白質(zhì)沉淀。引起蛋白質(zhì)沉淀的主要方法有鹽析、重金屬鹽沉淀、生物堿試劑以及某些酸類沉淀、有機(jī)溶劑沉淀、加熱凝固等。吳敏等人通過(guò)對(duì)生鮮牛乳進(jìn)行脫脂和水浴加熱后,加入蛋白質(zhì)沉淀劑、離心分離得到蛋白質(zhì)沉淀, 直接根據(jù)沉淀體積讀取出牛乳中蛋白質(zhì)含量。結(jié)果表明，在置信度大于90%時(shí),置信區(qū)間為(8.72±0.43),RSD為4.75%,此方法作為一種快速測(cè)量牛乳中蛋白質(zhì)的方法,可廣泛用于各個(gè)奶站和奶廠收奶,也可用于質(zhì)檢部門進(jìn)行快速檢測(cè),結(jié)果快速,比較準(zhǔn)確,費(fèi)時(shí)較短且成本低廉,不失為一種優(yōu)良的快速檢測(cè)方法。
3.10 Udy染料染色法
Udy染料染色法采用蛋白與一定pH的橙酸12染料結(jié)合的原理測(cè)定乳中的氨基酸,如精氮酸、組氨酸和賴氨酸,其中蛋白質(zhì)的多肽長(zhǎng)度須在5個(gè)氨基酸以上。其紅色的色澤隨蛋白的含量增加,即結(jié)合的越多而減退,即色澤的強(qiáng)弱與蛋白的濃度呈反比,因此只要在一定的波長(zhǎng)下測(cè)定其色澤的程度,即可計(jì)算得到真蛋白的濃度。用Udy染色法測(cè)定牛奶樣品中的真蛋白含量只需不到1min的時(shí)間, 1967年,該法得到AOAC認(rèn)可。
4 結(jié)論
由于中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中乳品蛋白質(zhì)檢測(cè)方法的缺陷,出現(xiàn)摻加尿素、銨肥甚至三聚氰胺等氮含量高的有機(jī)物來(lái)提高“蛋白質(zhì)含量”的違法操作,嚴(yán)重制約了我國(guó)乳制品的質(zhì)量提升,影響了消費(fèi)者的身體健康。近幾年來(lái)，關(guān)于乳品中真蛋白的檢測(cè)方法的研究也比較多，其中不乏有許多操作簡(jiǎn)便、對(duì)設(shè)備要求不高、檢測(cè)時(shí)間短，靈敏度較高的方法，如直讀法、數(shù)字圖像法、紫外分光光度法、三氯乙酸——雙縮脲法等。這些方法的研究對(duì)規(guī)范我國(guó)乳品中關(guān)于真蛋白的檢測(cè)具有推動(dòng)作用，為進(jìn)一步提升乳品質(zhì)量做出了貢獻(xiàn)。
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通過(guò)測(cè)定總氮含量而計(jì)算得到的蛋白質(zhì)含量稱為粗蛋白(crude protein,CP) ,目前國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法中測(cè)定的即為粗蛋白含量。乳中的氮含量包括蛋白態(tài)氮(proteinnitrogen,PN)和非蛋白態(tài)氮(non protein nitrogen,NPN),其中前者占95% ,后者約占5%。蛋白質(zhì)是乳中的主要含氮物質(zhì),含量約2.8%～3.8%。乳蛋白包括酪蛋白、乳清蛋白及少量脂肪球膜蛋白。乳清蛋白中有對(duì)熱不穩(wěn)定的乳白蛋白和乳球蛋白,上述蛋白構(gòu)成了乳中的“真蛋白”。
蛋白質(zhì)是牛奶的主要成分，且牛奶中的蛋白質(zhì)是完全的蛋白質(zhì)，由于含有人體必需的氨基酸，所以營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高，牛奶中的蛋白質(zhì)消化率可以達(dá)到90%～100%。乳中其他含氮物主要來(lái)源于乳中的氨、尿素、肌酸、肌酸酐、尿酸、乳清酸、多肽、馬尿酸、氨基酸和其他成分,這些成分構(gòu)成了非蛋白質(zhì)氮。
真蛋白(true protein,TP)即真正的蛋白質(zhì),在測(cè)定方面可定義為除了非蛋白質(zhì)氮以外的蛋白態(tài)氮所計(jì)算得到的蛋白,正常情況下,天然乳中真蛋白的含量少于粗蛋白。酪蛋白是乳品真蛋白中最重要的蛋白質(zhì),主要以膠束狀態(tài)存在于乳中,它是以含磷蛋白質(zhì)為主體的幾種蛋白質(zhì)的復(fù)合體,主要分為αs12酪蛋白、αs22酪蛋白、β2酪蛋白和κ2酪蛋白4種。一般情況下,乳品真蛋白中約有80%為酪蛋白,但其含量因個(gè)體差異、牧場(chǎng)管理、乳牛品種的不同而變化。
2.乳及乳制品中真蛋白測(cè)定的研究背景
牛奶及乳制品中含有豐富的蛋白質(zhì)，但在牛奶收購(gòu)、生產(chǎn)環(huán)節(jié)中，質(zhì)量摻假事件時(shí)有發(fā)生，尤以“劣質(zhì)假奶粉”事件和“三聚氰胺奶粉”事件為甚。目前，乳制品的消費(fèi)量很大，根據(jù)FAO統(tǒng)計(jì)，世界人均年消費(fèi)乳制品46kg，是日常飲食結(jié)構(gòu)的重要組成部分，它的安全性直接影響到人們的身體健康，所以一旦出現(xiàn)質(zhì)量或安全問(wèn)題，它暴露的受害人群和風(fēng)險(xiǎn)就會(huì)高一些。尤其牛奶對(duì)嬰幼兒有代母乳的作用，在嬰兒成長(zhǎng)的特定階段，成為其全部營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，因而，乳制品的安全至關(guān)重要，世界各國(guó)都對(duì)乳制品的質(zhì)量控制制定了相當(dāng)嚴(yán)密的標(biāo)準(zhǔn)體系。
目前檢測(cè)蛋白質(zhì)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法是凱氏定氮法，其結(jié)果只是氮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，而不是真正意義上的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。這種缺陷造成某些不法分子對(duì)牛奶進(jìn)行摻假，添加硫酸銨、三聚氰胺、水解植物或動(dòng)物蛋白等含氮物質(zhì)。要杜絕這類問(wèn)題，必須建立真蛋白質(zhì)的檢測(cè)方法。
3.乳品中真蛋白的測(cè)定方法：
3.1 電位滴定法
2009年唐偉英等人為排除牛乳中三聚氰胺等非蛋白氮的干擾，探索研究了電位滴定法測(cè)定牛乳中真蛋白的含量。它的基本原理為：蛋白質(zhì)的兩端有游離的具有酸性的羧基（－COOH）和堿性的氨基（－NH2），當(dāng)加入甲醛溶液時(shí)，氨基上的兩個(gè)氫原子被次甲基所取代，于是便失去了氨基的堿性特性，從而使其呈酸性的羧基釋放出來(lái)，使溶液的電化學(xué)特性發(fā)生變化。再用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定游離的羧基（－COOH），從而用經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算其蛋白質(zhì)含量。
與凱式定氮法相比，該法可以排除三聚氰胺、尿素對(duì)牛乳中蛋白質(zhì)測(cè)定的干擾，其次該方法所需檢測(cè)儀器及試劑常規(guī)，操作簡(jiǎn)便，而且大大縮短了測(cè)定時(shí)間，提高了工作效率，具有一定的推廣使用價(jià)值。但從其原理中不難得出此法不能排除銨態(tài)氮（氯化銨、硫酸銨、碳酸銨等）的干擾，有一定的局限性。針對(duì)這一漏洞唐英偉等人在2009年提出了改進(jìn)方法即：在測(cè)定前在試樣中加入濃堿液加熱檢查有無(wú)氨氣放出，驗(yàn)證有無(wú)銨態(tài)氮。若有，則先將銨態(tài)氮分離出去，再用電位滴定法測(cè)定；若沒(méi)有，則可直接用電位滴定法測(cè)定。
3.2 三氯乙酸-雙縮脲比色法
該方法的基本原理為：采用150g/L 的三氯乙酸溶液(在混合物中的最終濃度約為120g/L)沉淀乳中的蛋白質(zhì),用過(guò)濾法分離沉淀和溶液,沉淀部分含蛋白態(tài)氮,非沉淀部分(溶液)含非蛋白態(tài)氮。將濾渣收集起來(lái),再用雙縮脲法進(jìn)行定氮。即可得出樣品中的真蛋白含量。2011年侯彩云等人利用該方法提出了真蛋白率這一概念。并測(cè)定了添加過(guò)乳清蛋白乳粉的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果表明，乳清蛋白的加標(biāo)回收率在89.2%~99%之間，重現(xiàn)性在0.26%~0.98%之間，表明三氯乙酸-雙縮脲比色法可以較好地檢測(cè)出乳中的真蛋白。
該方法是對(duì)凱式定氮法的改進(jìn)，在樣品檢測(cè)前先將其中的蛋白質(zhì)沉淀，可以很好的排除三聚氰胺、尿素等非蛋白氮的干擾。后期采用雙縮脲法對(duì)濾渣進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測(cè)定，且操作簡(jiǎn)便迅速，可提高工作效率，但靈敏度比較低,測(cè)定范圍為1～20mg蛋白質(zhì),適用于精度要求不高的蛋白質(zhì)含量測(cè)定。
3.3 紫外分光光度法
紫外分光光度法的基本原理為：蛋白質(zhì)中含帶共軛雙鍵的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基,使蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì),其吸收峰在280nm 處,吸光度與蛋白質(zhì)含量成線性關(guān)系,因此,通過(guò)測(cè)蛋白質(zhì)溶液的吸光度,即可測(cè)得樣品中蛋白質(zhì)的含量。2010年陳靜等人采用紫外分光光度計(jì)，在280 nm波長(zhǎng)處，通過(guò)吸光度值來(lái)測(cè)定真蛋白質(zhì)量濃度；采用FT-120、甲醛滴定法、凱氏定氮法進(jìn)行對(duì)比驗(yàn)證；考察人為添加非蛋白類含氮物質(zhì)氯化銨、硫酸銨、尿素對(duì)真蛋白含量檢測(cè)結(jié)果的影響。測(cè)得蛋白質(zhì)量濃度的回收率在94.0%~106.7%之間，通過(guò)精密度實(shí)驗(yàn)，得到相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.06%。結(jié)果表明，紫外分光光度法檢測(cè)真蛋白質(zhì)量濃度與其他3種檢測(cè)方法差異不顯著；且檢測(cè)結(jié)果不受人為添加非蛋白類含氮物質(zhì)的影響。
紫外分光光度法檢測(cè)生鮮牛乳真蛋白質(zhì)量濃度，方法快速、可行，非蛋白態(tài)氮不能計(jì)入蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，可以有效防止不法分子以含氮有機(jī)物冒充蛋白質(zhì)的違法行徑。
3.4 考馬斯亮藍(lán)G-250法
考馬斯亮藍(lán)法是由考馬斯亮藍(lán)G-250染料與蛋白質(zhì)通過(guò)范德華引力結(jié)合,使蛋白質(zhì)染色,通過(guò)比色測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法。2007年南亞等人研究了最佳實(shí)驗(yàn)條件,成功地建立一個(gè)牛乳中蛋白質(zhì)快速測(cè)定的方法,具有簡(jiǎn)單、快捷、易行等特點(diǎn)。結(jié)果表明該方法精密度高,RSD為1.70%,結(jié)果準(zhǔn)確,相對(duì)誤差較小,回收率98.2%~100.3%。
考馬斯亮藍(lán)G-250與蛋白質(zhì)結(jié)合的反應(yīng)十分迅速且穩(wěn)定,這一方法具有靈敏度高、干擾物質(zhì)少、測(cè)定快速、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn),不受酚類、游離氨基酸和緩沖劑、絡(luò)合劑的影響,適合大量樣品的測(cè)定，可推廣到其他乳制品及保健食品、植物蛋白飲料等中的蛋白質(zhì)測(cè)定。但由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此用于不同蛋白質(zhì)測(cè)定時(shí)有較大的偏差。
3.5 凝膠柱層析——考馬斯亮藍(lán)染色法
考馬斯亮藍(lán)染色測(cè)定蛋白質(zhì)是一種經(jīng)典的方法，但按傳統(tǒng)方法配成的顯色劑卻存在著溶解不完全、比色池上極易沉積等問(wèn)題，實(shí)際操作時(shí)對(duì)測(cè)定的準(zhǔn)確性干擾較大。為此2010年張弘等人對(duì)考馬斯亮藍(lán)顯色劑中進(jìn)行了改良，加入了大分子的醇類和酚類物質(zhì)，新研制的顯色劑溶液溶解度好，比色池上沉積很少，且穩(wěn)定，存放一年不影響測(cè)定。此外還研發(fā)出了牛奶蛋白質(zhì)快速檢測(cè)儀，該儀器體積小、操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)速度快、靈敏度高，且能有效消除添加的三聚氰胺、尿素、硫酸銨等無(wú)機(jī)氮，及水解植物和動(dòng)物蛋白等小分子多肽氮對(duì)牛奶中蛋白質(zhì)檢測(cè)的干擾，從而能從根本上杜絕牛奶中摻假蛋白檢測(cè)題，可用于現(xiàn)場(chǎng)牛奶真蛋白質(zhì)快速檢測(cè)。結(jié)果表明，牛奶中蛋白質(zhì)分子量絕大部分集中分布在1×104~7×104u以上和1×104u以下分子量的蛋白質(zhì)所占的比例很小。綜合應(yīng)用牛奶中蛋白質(zhì)的分子量分布特征和考馬斯亮藍(lán)染色法的特性研發(fā)出。
該法通過(guò)對(duì)考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行改良，基于馬斯亮藍(lán)染色法的特性和牛奶中蛋白質(zhì)分子量的分布特征研制出牛奶蛋白質(zhì)快速檢測(cè)儀。分子量約1ku以上含氮物中的肽鏈和考馬斯亮藍(lán)結(jié)合，在波長(zhǎng)595nm處達(dá)到最大吸收值。牛奶中的蛋白質(zhì)主要是酪蛋白和清蛋白兩大類，它們的分子量大多在1×104 ~3×104u；蛋白質(zhì)分離檢測(cè)儀檢測(cè)的結(jié)果表明：牛奶中的蛋白質(zhì)分子量集中分布在1×104~7×104u，和考馬斯亮藍(lán)的顯色作用非常明顯，因此靈敏度很高。牛奶中的其他物質(zhì)，如脂肪、多糖、維生素等均不與考馬斯亮藍(lán)作用，摻假物質(zhì)，如三聚氰胺、尿素和硫酸銨等基本也不顯色，因此能有效識(shí)別；而水解植物和動(dòng)物蛋白中，大部分是小分子肽，只有很少一部分的大分子蛋白質(zhì)才能顯色，但如果要達(dá)到和牛奶相同的顯色值，含氮量要達(dá)到牛奶的20倍左右才能做到，因此，用牛奶蛋白質(zhì)快速檢測(cè)儀測(cè)定蛋白質(zhì)，可有效地防止牛奶中摻假蛋白質(zhì)的干擾，從而能從根本上杜絕牛奶中摻假蛋白的檢測(cè)問(wèn)題，可用于現(xiàn)場(chǎng)牛奶真蛋白質(zhì)的快速檢測(cè)。
3.6 毛細(xì)管電泳法
電泳是指在電場(chǎng)作用下,帶電粒子向著與其所帶電荷電性相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象。電泳法,就是指帶電荷的供試品(如蛋白質(zhì)、核苷酸等) 在惰性支持介質(zhì)(如濾紙、醋酸纖維素、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等) 中,在電場(chǎng)的作用下,向其對(duì)應(yīng)的電極方向按各自的速度進(jìn)行泳動(dòng),由于各組分之間的移動(dòng)速度不同,使各組分分離成狹窄的區(qū)帶,并用適宜的檢測(cè)方法記錄其電泳區(qū)帶圖譜或計(jì)算其百分含量的方法。
毛細(xì)管電泳法也稱高效毛細(xì)管電泳法,它是近十幾年發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新的分析方法,結(jié)合了電泳和色譜兩大技術(shù)。Miralles等人用CE法對(duì)乳中變性的β2乳球蛋白和對(duì)位2κ2酪蛋白進(jìn)行了分離和定量測(cè)定,并研究了pH值、尿素濃度、檸檬酸濃度、電壓等因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響,結(jié)果表明該法可在30min完成乳制品中變性β2乳球蛋白和對(duì)位2κ2酪蛋白的定量檢測(cè)。但是由于該法使用的儀器昂貴、操作較為復(fù)雜,在一定程度上限制了它的應(yīng)用范圍。
3.7 紅外光譜分析法
近紅外光譜是介于可見光(VIS)和中紅外光(MIR 或IR)之間的電磁波, 美國(guó)材料檢測(cè)協(xié)會(huì)(ASTM) 將近紅外光譜區(qū)定義為波長(zhǎng)780～2 526 nm的光譜區(qū)。通過(guò)分子振動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)的狀態(tài)變化在不同能級(jí)間產(chǎn)生躍遷,當(dāng)其能量與近紅外光譜區(qū)內(nèi)某一波長(zhǎng)處光子的能量相當(dāng)時(shí),可產(chǎn)生近紅外光譜吸收。食品中蛋白質(zhì)和多肽在這個(gè)波段的特征吸收可以用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)的含量。
近紅外光譜技術(shù)的主要特點(diǎn)有:分析速度快、分析效率高、適用的樣品范圍廣,對(duì)樣品無(wú)損傷等。已廣泛應(yīng)用于谷物、乳類、肉類、烘焙類、豆類蛋白質(zhì)的分析測(cè)定中,但儀器價(jià)格昂貴,靈敏度相對(duì)較低。
3.8 數(shù)字圖像法
該方法是基于雙縮脲反應(yīng)原理, 通過(guò)一次性采集標(biāo)樣和試樣乳粉處理液的圖像信息,得出試樣乳粉的蛋白質(zhì)含量。
王旭等人利用凱氏定氮法和數(shù)字圖像法測(cè)定添加了不同NPN的乳粉蛋白質(zhì)含量,分析非蛋白態(tài)氮對(duì)凱氏定氮法和數(shù)字圖像法測(cè)定乳粉蛋白質(zhì)含量的影響。結(jié)果表明，對(duì)于沒(méi)有人為添加非蛋白態(tài)氮的乳粉來(lái)說(shuō), 用凱氏定氮法和數(shù)字圖像法測(cè)定結(jié)果具有較好的一致性。當(dāng)乳粉中含有大量NPN時(shí), 凱氏定氮法測(cè)得的粗蛋白含量無(wú)法體現(xiàn)蛋白質(zhì)的真實(shí)情況。一旦乳粉中惡意添加大量非蛋白態(tài)氮,采用數(shù)字圖像法測(cè)定蛋白質(zhì)含量, 其結(jié)果不受干擾。數(shù)字圖像法大體上可以看作針對(duì)真蛋白質(zhì)特有的反應(yīng), 非蛋白態(tài)含氮物質(zhì)對(duì)測(cè)定結(jié)果沒(méi)有影響, 測(cè)定乳粉中的真蛋白含量具有較高的準(zhǔn)確性。
3.9 直讀法
蛋白質(zhì)分子凝聚從溶液中析出的現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)沉淀(precipitation),變性蛋白質(zhì)一般易于沉淀,但也可不變性而使蛋白質(zhì)沉淀。引起蛋白質(zhì)沉淀的主要方法有鹽析、重金屬鹽沉淀、生物堿試劑以及某些酸類沉淀、有機(jī)溶劑沉淀、加熱凝固等。吳敏等人通過(guò)對(duì)生鮮牛乳進(jìn)行脫脂和水浴加熱后,加入蛋白質(zhì)沉淀劑、離心分離得到蛋白質(zhì)沉淀, 直接根據(jù)沉淀體積讀取出牛乳中蛋白質(zhì)含量。結(jié)果表明，在置信度大于90%時(shí),置信區(qū)間為(8.72±0.43),RSD為4.75%,此方法作為一種快速測(cè)量牛乳中蛋白質(zhì)的方法,可廣泛用于各個(gè)奶站和奶廠收奶,也可用于質(zhì)檢部門進(jìn)行快速檢測(cè),結(jié)果快速,比較準(zhǔn)確,費(fèi)時(shí)較短且成本低廉,不失為一種優(yōu)良的快速檢測(cè)方法。
3.10 Udy染料染色法
Udy染料染色法采用蛋白與一定pH的橙酸12染料結(jié)合的原理測(cè)定乳中的氨基酸,如精氮酸、組氨酸和賴氨酸,其中蛋白質(zhì)的多肽長(zhǎng)度須在5個(gè)氨基酸以上。其紅色的色澤隨蛋白的含量增加,即結(jié)合的越多而減退,即色澤的強(qiáng)弱與蛋白的濃度呈反比,因此只要在一定的波長(zhǎng)下測(cè)定其色澤的程度,即可計(jì)算得到真蛋白的濃度。用Udy染色法測(cè)定牛奶樣品中的真蛋白含量只需不到1min的時(shí)間, 1967年,該法得到AOAC認(rèn)可。
4 結(jié)論
由于中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中乳品蛋白質(zhì)檢測(cè)方法的缺陷,出現(xiàn)摻加尿素、銨肥甚至三聚氰胺等氮含量高的有機(jī)物來(lái)提高“蛋白質(zhì)含量”的違法操作,嚴(yán)重制約了我國(guó)乳制品的質(zhì)量提升,影響了消費(fèi)者的身體健康。近幾年來(lái)，關(guān)于乳品中真蛋白的檢測(cè)方法的研究也比較多，其中不乏有許多操作簡(jiǎn)便、對(duì)設(shè)備要求不高、檢測(cè)時(shí)間短，靈敏度較高的方法，如直讀法、數(shù)字圖像法、紫外分光光度法、三氯乙酸——雙縮脲法等。這些方法的研究對(duì)規(guī)范我國(guó)乳品中關(guān)于真蛋白的檢測(cè)具有推動(dòng)作用，為進(jìn)一步提升乳品質(zhì)量做出了貢獻(xiàn)。
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