人外周血染色體制備

一、原理
人外周血小淋巴細胞，通常都處在G1期（或G0期），一般情況下不進行分裂。如在培養(yǎng)液中加入植物血凝素（PHA），這種小淋巴細胞受到刺激可轉(zhuǎn)化為淋巴母細胞，進入有絲分裂。短期培養(yǎng)后，經(jīng)秋水仙素處理，低滲和固定，即可得到大量的有絲分裂細胞。人體的1ml外周血內(nèi)一般含有約1×106～3×106個小淋巴細胞，足夠染色體標本制備和分析之用。
二、用品和試劑
1．5ml注射器（7號針尖），培養(yǎng)瓶、刻度吸管，需15磅滅菌20分鐘。離心管、吸管、量筒、載玻片，經(jīng)洗液按常規(guī)清洗、烘干備用。
2．超凈工作臺，恒溫培養(yǎng)箱，天平，離心機、顯微鏡等。
3．試劑：
（1）RPMI-1640按要求10.4克/1000ml配制成溶液，并加入NaHCO3 2.0克/1000ml以緩沖pH。完全溶解后經(jīng)0.22 μm滅菌濾膜抽濾除菌。
（2）肝素鈉（肝素）：稱取0.2g溶于100ml雙蒸水中，濃度為0.2%，15磅20分鐘滅菌。
（3）秋水仙堿（秋水仙素〕，生理鹽水配制成10μg/ml濃度，15磅20分鐘滅菌，分裝，置－20℃。
（4）低滲液：0.35％KCl。
（5）固定液（Carnoy固定液） 甲醇∶冰乙酸（3∶l），臨時配制。
（6）Giemsa工作液：1份原液和10份磷酸緩沖液，臨時配制。
（7）磷酸緩沖液：1/15M Na2HPO4、1/15M KH2PO4等體積混和。
（8）5% NaHCO3滅菌濾器抽濾備用。
三、操作步驟
（一）細胞培養(yǎng)
1．培養(yǎng)基的配制：
在超凈工作臺中，100ml培養(yǎng)基含以下成分和比例：
RPMI-1640 84ml
小牛血清 15ml
PHA 3支
肝素鈉 1ml
卡那霉素 終濃度為100單位/ml
以5% NaHCO3（無菌）或1N HCl調(diào)pH至7.2－7.4。
用刻度吸管將培養(yǎng)液分裝入培養(yǎng)瓶（10ml/瓶），4℃?zhèn)溆谩?br />2．采血：酒精消毒皮膚，肘靜脈采血0.3—0.5ml，立刻將注射針直接穿過培養(yǎng)瓶的橡膠塞，向10ml培養(yǎng)基中注入30—40滴全血，輕搖勻后置37℃恒溫箱培養(yǎng)。
3．培養(yǎng)：時間為68小時。培養(yǎng)期間，定期輕搖勻，使細胞充分接觸培養(yǎng)基。
4．秋水仙素處理：終止培養(yǎng)前2—4小時，在培養(yǎng)液中加入秋水仙堿（用1ml注射器5號針尖滴加2滴，使終濃度為0.07μg/ml）。
以上步驟均需無菌操作
（二）染色體制備
1．收集細胞：將培養(yǎng)物全部轉(zhuǎn)入潔凈離心管中，以1000rpm離心8—10分鐘，棄上清液。
2．低滲處理：向刻度離心管中加入預溫37℃的低滲液8ml，用滴管混勻，置37℃恒溫水浴中低滲15—25分鐘。
3．預固定：低滲后加入0.5ml固定液，輕輕混勻后1000rpm離心8—10分鐘。
4．一固定：棄上清液，加入5ml固定液，輕輕混勻，靜置20分鐘。1000rpm離心，棄上清液。
5．二固定、三固定：同一固定。
6．制懸液：棄上清液后，視細胞數(shù)量多少加入適量固定液制成細胞懸液。
7．滴片：吸取細胞懸液自10—20cm高滴在一張干燥潔凈的載玻片上，輕吹散，氣干。
8．染色：1:10 Giemsa染色5—10分鐘，細水洗去多余染液，氣干。
9．鏡檢：低倍鏡下尋找分散良好、染色適中的分裂相，油鏡下觀察染色體形態(tài)并計數(shù)。
四、注意事項
l．培養(yǎng)溫度應嚴格控制在37±0.5℃，培養(yǎng)液最適合pH為7.2—7.4。
2．秋水仙素處理時間過長，分裂細胞多，染色體短��；反之，則少而細長。都不宜觀察形態(tài)及計數(shù)。故秋水仙素的濃度及時間要準確掌握。
3．低滲使紅細胞膜破裂，淋巴細胞膨脹，低滲處理濃度及時間要適當。且低滲后混勻細胞一定要輕，否則引起膜破裂、染色體散失。
4．離心前配平，離心速度過高，細胞團不易打散；反之，細胞易丟失。
5．固定液應在使用前臨時配制。
6．載玻片一定要潔凈，否則染色體分散不好。