（一）制片
選無自發(fā)性熒光的石英玻片或普通優(yōu)質(zhì)玻片，洗凈后浸泡于無水乙醇和乙醚等量混合液中。用時取出用綢布擦凈。將待檢樣品如組織塊剪成適當(dāng)大小印壓于玻片上。也可采用冰凍切片或石蠟切片樣品。
（二）固定
除研究細(xì)胞表面抗原或不穩(wěn)定抗原可不固定外，一般均應(yīng)固定。固定的作用有三：①防止標(biāo)本從玻片上脫落；②除去防礙抗原—抗體結(jié)合的類脂，使抗原抗體結(jié)合物易于獲得良好的染色結(jié)果；③固定的標(biāo)本易于保存，如組織切片固定后在-20℃下可保存一年而不改變其染色特性。
標(biāo)本的固定原則是：①不能損傷細(xì)胞內(nèi)的抗原；②不能凝集蛋白質(zhì)；③不能損傷細(xì)胞形態(tài)；④固定后應(yīng)保持細(xì)胞膜的通透性，以允許抗體進(jìn)入與抗原結(jié)合。
表 常用抗原物質(zhì)的固定方法
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抗原物質(zhì) |
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固定劑 |
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固定條件（min） |
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蛋白質(zhì)抗原 |
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95%～100%乙醇 |
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室溫3～10 |
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酶、激素 |
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丙 酮 |
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4℃ 30 |
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免疫球蛋白 |
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四氯化碳 |
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病 毒 |
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丙酮、四氯化碳、無水乙醇 |
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室溫5～10或4℃ 30～60 |
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多糖、細(xì)菌等 |
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微火加熱，甲醇、10%甲醛、丙酮 |
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室溫5～10或4℃ 30～60 |
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類 脂 （異嗜性抗原） |
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10%甲醛，10%佛茂爾（ForMol） |
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室溫3～10 |
（三）水洗
固定后以冷的0.01Mol/L pH7.4PBS液浸泡沖洗，最后以蒸餾水沖洗，防止自發(fā)性熒光。
（四）染色
染色分直接染色法與間接染色法。
1． 材料與試劑
（1）熒光抗體，稀釋至應(yīng)用濃度。
（2）0.01Mol/L pH7.4PBS液
（3）9份優(yōu)質(zhì)甘油加1份pH7.4PBS液即為甘油緩沖液。甘油有減少非特異性熒光的作用。
（4）帶蓋方盤
2．直接染色法
（1）將固定好的玻片置于濕盤中，滴加熒光抗體染色液，以覆蓋為度，加蓋，37℃感做30 min～45min。
（2）PBS沖洗3次，每次沖洗3min，即3×3ˊ沖洗。
（3）蒸餾水沖洗。
（4）滴甘油緩沖液一滴，封片，熒光顯微鏡檢查。
2． 間接染色法
（1） 檢查抗原：①取固定標(biāo)本，加已知的免疫血清，37℃孵育30min；②以PBS液3×3ˊ沖洗；③再加熒光標(biāo)記的抗抗體，37℃孵育30min；④PBS 3×3ˊ沖洗；⑤H2O沖洗，涼干；⑥加甘油緩沖液，封片、鏡檢。
（2） 檢查抗體：①以免疫后動物的淋巴組織涂片，自然干燥，甲醇固定；②滴加相應(yīng)抗原液（按1﹕100～1﹕500稀釋），37℃孵育30min；③PBS液3×3ˊ沖洗；④加熒光抗體，37℃孵育30min；⑤PBS液3×3ˊ沖洗；⑥水洗，涼干；⑦加甘油緩沖液，封片、鏡檢。
（五）結(jié)果顯示
熒光顯微鏡所觀察到的圖象，主要以兩個指標(biāo)判斷結(jié)果，一個是形態(tài)學(xué)特征；另一個是熒光的亮度，在結(jié)果的判定中，必須將二者結(jié)合起來，綜合判定。
熒光強(qiáng)度的表示方法如下：
＋＋＋ ～ ＋＋＋＋：熒光閃亮，呈明顯的亮綠色。
＋＋ ：熒光明亮，呈黃綠色。
＋ ：熒光較弱，但清楚可見。
± ：極弱的可疑熒光。
－ ：無熒光。
（六）標(biāo)本保存
由于熒光色素和蛋白質(zhì)分子的穩(wěn)定性都是相對的，因此隨著保存時間的延長，在各種條件影響下，標(biāo)記蛋白可能變性解離，失去其應(yīng)有的亮度和特異性。因此給標(biāo)本的保存帶來一定的困難，所以在標(biāo)本進(jìn)行熒光染色之后應(yīng)立即觀察。
保存的方法可采取以下幾種：①固定標(biāo)本片以后低溫保存，隨用隨染；②染色片采取優(yōu)質(zhì)封固劑，如特別的熒光封固劑（Fluormount）或堿性優(yōu)質(zhì)純甘油固劑等封固。這些封固劑能防止熒光激發(fā)，封固后低溫保存；④可以采用拍照保存照片。